吳青一

摘 要 目的：建立清潔驗(yàn)證中殘留物鹽酸米那普侖含量測(cè)定的高效液相色譜法。方法：色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×150 mm，5 mm），流動(dòng)相為 0.2%十二烷基磺酸鈉溶液-乙腈（50∶50，含0.1%三乙胺），用磷酸調(diào)至pH 3.8，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速0.6 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 ml。結(jié)果：鹽酸米那普侖在0.65～2.59 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，平均回收率為76.83%，RSD=5.23%（n=18）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于清潔驗(yàn)證殘留物鹽酸米那普侖的定量分析。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 鹽酸米那普侖 清潔驗(yàn)證 定量限 檢測(cè)限

中圖分類號(hào)：TQ460.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）05-0077-04

Determination of milnacipran hydrochloride residues in cleaning validation by HPLC

WU Qingyi*

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of milnacipran hydrochloride residues in the cleaning validation by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Diamonsil C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） with a mixture of 0.2% sodium dodecyl sulfonate- acetonitrile （50：50， containing 0.1% triethylamine） as the mobile phase （pH 3.8 adjusted with phosphoric acid）， at the detection wavelength of 210 nm， the flow rate of 0.6 ml/min， the column temperature of 30 ℃ and the injection volume of 10 μl. Results： The standard curve of milnacipran hydrochloride showed a good linear relationship over the range of 0.65 to 2.59 μg/ml with the correlation coefficient （r） of 0.999 5. The average recovery of samples was 76.83% with RSD of 5.23% （n=18）. Conclusion： This method is convenient， quick and accurate， and suitable for the quantitative determination of milnacipran hydrochloride residues in the cleaning validation.

KEY WORDS HPLC； milnacipran hydrochloride； cleaning validation； limit of quantitation； limit of detection

鹽酸米那普侖是一種新型特異性的5-HT和NE再攝取雙重抑制劑，臨床上不僅可以用于抑郁癥的急性期治療和維持期治療，還可以用于治療中風(fēng)后抑郁、腦外傷后抑郁以及慢性疼痛綜合征，且無(wú)三環(huán)類藥物常見(jiàn)的嗜睡和抗膽堿能作用，惡心和嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)較選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物（SSRIs）少見(jiàn)，是一種十分有前景的抗抑郁藥[1]。其制劑鹽酸米那普侖片是本公司開(kāi)發(fā)，目前與其他產(chǎn)品共線生產(chǎn)。為確保不造成交叉污染、降低本品的生產(chǎn)對(duì)其他產(chǎn)品造成的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，提高藥品的安全性，需要對(duì)生產(chǎn)用設(shè)備進(jìn)行有效清洗。本研究根據(jù)藥品GMP要求，通過(guò)計(jì)算，確定鹽酸米那普侖片清潔驗(yàn)證設(shè)備殘留限度為0.32 mg/cm2 [2-3]。殘留物分析方法的可靠性是清潔驗(yàn)證的重要保障[4]，因此，必須對(duì)殘留物的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。本研究參考中國(guó)藥典要求[5]和鹽酸米那普侖片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法[6]，建立了殘留物鹽酸米那普侖的HPLC分析方法，并對(duì)每個(gè)驗(yàn)證參數(shù)設(shè)立了可接受標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)方法驗(yàn)證，確定該方法能保證清潔驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，可用于該產(chǎn)品清潔驗(yàn)證中殘留物的檢測(cè)及定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；XS205電子分析天平（瑞士Mettler公司）；鹽酸米那普侖對(duì)照品（批號(hào)：P302-1603001，含量：100.0%，上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司）；無(wú)水乙醇（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC純，美國(guó)默克公司）；十二烷基磺酸鈉（AR，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；三乙胺、磷酸（HPLC純，美國(guó)Tedia公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18 （4.6 mm×150 mm，5 mm；北京迪馬科技有限公司）；流動(dòng)相為 0.2%十二烷基磺酸鈉溶液-乙腈（50∶50，含0.1%三乙胺），用磷酸調(diào)pH至3.8； 檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速0.6 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 ml。

1.2.2 溶液配制

1）對(duì)照品貯備液 精密稱取鹽酸米那普侖對(duì)照品32 mg，加水溶解并稀釋至200 ml，作為對(duì)照品貯備液（160 mg/ml）。

2）對(duì)照品溶液 精密量取對(duì)照品貯備液1.0 ml，置100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液（1.6 mg/ml）。

3）空白棉花浸出液 用鑷子夾取醫(yī)用脫脂棉兩小團(tuán)，用乙醇潤(rùn)濕后放入10 ml具塞試管中，加入5 ml 純化水，超聲5 min，放置10 min，不時(shí)振搖，取上清液即得。

4）線性試驗(yàn)用溶液 分別精密量取對(duì)照品貯備液0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 ml，置100 ml量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，即得。

5）回收率試驗(yàn)用溶液 精密量取對(duì)照品貯備液5.0 ml，置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。

1.2.3 不銹鋼板擦拭取樣

在一塊面積為25 cm×25 cm的平整光潔的不銹鋼板上用鋼錐每隔5 cm劃線，形成25塊5 cm×5 cm的正方塊。精密量取回收率試驗(yàn)用溶液0.1 ml均勻地滴加在不銹鋼板中間的1個(gè)正方塊上，用電吹風(fēng)吹干，按圖1方法用棉簽擦拭各個(gè)方塊。

用鑷子夾取一小團(tuán)脫脂棉花，先用無(wú)水乙醇潤(rùn)濕，并將其靠在溶劑瓶上以除去多余的無(wú)水乙醇。將棉團(tuán)平穩(wěn)而緩慢地擦拭取樣表面（面積為5 cm×5 cm）。在向前移動(dòng)的同時(shí)將其從一邊移動(dòng)到另一邊。擦拭過(guò)程應(yīng)覆蓋整個(gè)表面。翻轉(zhuǎn)棉團(tuán)，讓棉團(tuán)的另一面也進(jìn)行擦拭，但與前次擦拭移動(dòng)的方向垂直（圖1）。擦拭好的棉團(tuán)立即放入10 ml的具塞試管中，另取一新的用無(wú)水乙醇潤(rùn)濕的棉團(tuán)，將方塊中殘留的溶液擦拭干凈，放入同一10 ml具塞試管中，加入5 ml 純化水，超聲5 min，放置10 min，不時(shí)振搖，作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

精密量取空白棉花浸出液和對(duì)照品溶液各10 ml進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果表明，空白棉花浸出液在鹽酸米那普侖峰位置無(wú)雜質(zhì)峰（圖2中保留時(shí)間5.522 min），對(duì)鹽酸米那普侖殘留測(cè)定無(wú)干擾。

2.2 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)

根據(jù)擦拭取樣限度0.32 mg/cm2計(jì)算可知，供試品溶液的檢出限度應(yīng)為1.6 mg/ml。故采用對(duì)照品溶液（1.6 mg/ml）進(jìn)行系統(tǒng)精密度試驗(yàn)。精密量取對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行液相色譜儀分析，峰面積分別為85 358、85 305、85 277、85 027、85 228，平均峰面積為85 239，RSD為0.16%（應(yīng)≤1.5%），理論塔板數(shù)為9 886（應(yīng)≥8 000）。表明系統(tǒng)重復(fù)性良好，系統(tǒng)適用性符合規(guī)定。

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取5個(gè)濃度的線性試驗(yàn)用溶液各10 ml進(jìn)行液相色譜儀分析，其測(cè)定值分別為0.647 2、1.132 6、1.618 0、2.103 4、2.588 8 mg/ml。以濃度X為橫坐標(biāo)，以鹽酸米那普侖峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程Y = 54 046X- 1 328，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5。結(jié)果表明，在0.65～2.59 mg/ml濃度范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好（圖3）。

2.4 檢測(cè)限和定量限

將0.64 mg/ml線性試驗(yàn)用溶液用純化水不斷稀釋，精密量取10 ml進(jìn)行液相色譜儀分析。根據(jù)信噪比法，分別以信噪比（S/N）10∶1和3∶1得出鹽酸米那普侖的定量限為12.8 ng/ml，檢測(cè)限為6.4 ng /ml。

2.5 擦拭取樣法回收率

由一個(gè)取樣人員平行擦拭3組，每組6份，精密量取上述供試品各10 μl進(jìn)行色譜分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中鹽酸米那普侖的殘留量。三組平均回收率為76.83%（應(yīng)≥50%），RSD為4.45%（應(yīng)≤20%），符合規(guī)定（表1）。鹽酸米那普侖片清潔驗(yàn)證設(shè)備殘留限度的測(cè)定限值應(yīng)為“鹽酸米那普侖殘留量限值×回收率”，為確保安全，按最嚴(yán)格要求該回收率應(yīng)為三組平均回收率的最小值74.11%，故測(cè)定限值為0.24 mg/cm2。

2.6 溶液的穩(wěn)定性

于0、2、4、6、8、10、12、14和16 h各取供試品溶液10 ml進(jìn)行液相色譜儀分析，以不同進(jìn)樣時(shí)間（溶液放置時(shí)間）主峰面積的變化情況來(lái)確定供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，供試品溶液放置16 h內(nèi)穩(wěn)定，其主峰面積的RSD為0.33%（應(yīng)≤2.0%）（圖4）。

3 討論

設(shè)備清潔驗(yàn)證是制藥企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中防止共線產(chǎn)品交叉污染、生產(chǎn)穩(wěn)定可控，藥品質(zhì)量安全可靠，確?；颊哂盟幇踩闹匾侄沃弧Ｇ鍧嶒?yàn)證中，影響驗(yàn)證結(jié)果的因素眾多，如清潔規(guī)程的評(píng)估、產(chǎn)品評(píng)估、設(shè)備評(píng)估、目標(biāo)化合物的選擇、檢驗(yàn)方法的選擇和評(píng)估等等[7-8]，而其中，采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法，是保證分析結(jié)果真實(shí)可靠的前提條件[9]。

用HPLC法進(jìn)行清潔驗(yàn)證的要求不同于成品檢驗(yàn)，要盡快出峰，以配合清潔操作的完成[10]。本試驗(yàn)參照鹽酸米那普侖片的含量測(cè)定方法，選用150 mm長(zhǎng)的短柱，使得主峰出峰時(shí)間提早到5～6 min，有利于生產(chǎn)線清洗完成后立即取樣檢測(cè)。相對(duì)于文獻(xiàn)方法[11-13]，本法簡(jiǎn)便、快速， 結(jié)果準(zhǔn)確，可用于清潔驗(yàn)證中鹽酸米那普侖殘留物的定量分析。

本研究取樣回收率試驗(yàn)雖然符合規(guī)定，但結(jié)果偏低，故還應(yīng)該予以關(guān)注。因?yàn)椴煌脑O(shè)備材質(zhì)，設(shè)備表面的平滑程度以及不同的擦拭力度，對(duì)采樣結(jié)果會(huì)有不同程度的影響[14]。因此在設(shè)備清潔驗(yàn)證中應(yīng)由方法驗(yàn)證進(jìn)行回收率試驗(yàn)時(shí)的取樣人員采用同等力度進(jìn)行擦拭取樣，如更換取樣人員，應(yīng)重新進(jìn)行相應(yīng)的方法擦拭回收率試驗(yàn)。同時(shí)當(dāng)情況發(fā)生改變時(shí)如分析儀器的改變，生產(chǎn)工藝的改變，或清潔規(guī)程的改變等，都有可能影響原分析方法的準(zhǔn)確性，故清潔驗(yàn)證的分析方法需進(jìn)行再驗(yàn)證[9]。

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