吳光麗 孫瑋宏 董高峰 王毅 宋鵬飛 馬永凱 魏云林 季秀玲 李海燕

摘要：為較全面的了解云南復烤煙葉在不同地點醇化過程中真菌多樣性，挖掘其中的有益微生物，提高煙草醇化品質(zhì)，以復烤煙葉為試驗材料，利用18S rDNA克隆測序技術(shù)，系統(tǒng)研究了其醇化過程中可培養(yǎng)真菌的種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，醇化過程中，復烤煙葉葉面真菌數(shù)量除曲靖倉庫在6月有所上升外，其余各地均隨著醇化的進行而逐漸下降，其中曲靖和楚雄兩地非常接近，元江最少；通過形態(tài)特征及18S rDNA鑒定，煙葉葉面真菌包括根霉屬真菌、青霉屬真菌、曲霉屬真菌等24個真菌屬（種）。不同地點，不同時期煙葉葉面真菌的數(shù)量、種類及優(yōu)勢種群不盡相同，而根霉屬真菌始終為優(yōu)勢種群。

關(guān)鍵詞：復烤煙葉；醇化；真菌：18S rDNA

煙葉是一種經(jīng)濟價值較高的商品，是卷煙工業(yè)的主要原料。由于當年復烤的煙葉存在刺激性大、青雜氣重、煙氣粗糙、余味澀口、香氣不夠顯露等特點，不適宜直接進行卷煙生產(chǎn)，需經(jīng)過一段時間的醇化來改善煙葉化學成分協(xié)調(diào)性及評吸質(zhì)量，從而達到生產(chǎn)標準。在煙葉醇化過程中，微生物及其產(chǎn)生的酶發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用微生物不僅可以通過自身的生命活動作用于煙葉醇化過程，還可通過其代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng)，促進煙葉中生物大分子的轉(zhuǎn)化。有研究表明，將微生物或酶用于煙葉醇化可縮短醇化時間，提高煙葉品質(zhì)和改善煙氣特性。相反，如果醇化過程中某類微生物過度繁殖，則會影響煙葉醇化品質(zhì)，后續(xù)的卷煙生產(chǎn)及質(zhì)量控制。因此，研究醇化過程中微生物的變化規(guī)律，對調(diào)控微生物作用，提高醇化效率，乃至揭示煙葉醇化機理具有重要意義。關(guān)于煙葉醇化過程中微生物變化已有不少研究，但關(guān)于復烤煙葉不同地點醇化其葉面微生物的變化卻鮮有報道。

云南是我國煙草原料大省，然而云南立體氣候特點明顯、不同地區(qū)生態(tài)條件差異顯著，勢必影響到微生物群落結(jié)構(gòu)差異，從而對煙葉醇化品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。但目前尚未見關(guān)于云南復烤煙葉不同地點醇化過程中葉面可培養(yǎng)真菌群落結(jié)構(gòu)的比較研究?；诖耍狙芯繉χ糜趶浝?、曲靖、元江、楚雄4地的紅花大金元復烤煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量、種類及其動態(tài)變化規(guī)律進行研究，為進一步研究煙葉醇化機理和人工調(diào)控煙葉醇化進程提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

本試驗所用的煙葉為紅云紅河集團及紅塔集團2014年的紅花大金元復烤煙葉，共選取7個樣品進行試驗，分別為昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、紅河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。

1.2醇化地點及氣候條件

所有供試紅花大金元（簡稱紅大，HD）復烤煙葉樣品均分別入庫彌勒、曲靖、元江和楚雄4個倉儲地。彌勒煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為73.3%，曲靖煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為58.2%，元江煙葉倉庫的年平均氣溫24.36℃、濕度為65%，楚雄煙葉倉庫的年平均氣溫20.5℃、濕度為59.6%。

1.3取樣及真菌分離

于2015年4、10月：2016年1、7、9月于每個醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17個月的煙草樣品，采用無菌袋（1500 g/袋）密封包裝，每地7個樣，共140個樣品，測定煙葉葉面真菌種類及數(shù)量。

在無菌條件下，從每個煙葉樣品中隨機選取50個煙葉片段，然后用無菌剪刀剪成1cmx1cm大小組織塊，并從中隨機取30個組織塊貼于PDA平板上（10個組織塊/平板，平板直徑為90mm），28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～55 d，隔天觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有真菌長出，則將其挑取并轉(zhuǎn)接到新鮮PDA平板上，純化后接于PDA斜面進行分類、鑒定及保藏。

1.4菌株鑒定

1.4.1形態(tài)學鑒定根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長速率、質(zhì)地和分泌物狀態(tài)與顏色等，將分離得到的真菌分為不同的形態(tài)類群（morphotype）之后，從各類群中隨機挑取3-5株接種于PDA平板上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，通過對孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)與大小、產(chǎn)孢方式與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征來確定菌株的分類地位。對于不產(chǎn)孢的菌株，則進行促孢培養(yǎng)，產(chǎn)孢后按上述方法進行鑒定。對于利用各種方法促孢后仍然不產(chǎn)孢的類群，則依據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、生長速率，菌絲顏色、粗細和結(jié)構(gòu)等特征劃分為不同的無孢類群組（mycelia sterile）。

1.4.2分子鑒定

對于那些不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢后仍不能確定其分類地位的菌株，則通過測定其18S rDNA序列，并與Genebank上的序列比對后，再結(jié)合其形態(tài)特征來確定其分類地位。具體做法為：將供試菌株從斜面轉(zhuǎn)接到PDA平板上進行活化，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取菌株基因組DNA。隨后利用真菌ITS通用引物ITSl（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，合格后送碩擎生物科技有限公司進行測序。所得序列與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的序列進行比對，根據(jù)覆蓋率和相似度并結(jié)合形態(tài)學特征確定其分類地位。

2結(jié)果

2.1煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量及其動態(tài)變化

從彌勒、曲靖、元江、楚雄4個醇化地、5個不同醇化時間點的140個煙葉樣品的4200個煙葉片段中，共分離得到1636株真菌，其在醇化過程中各醇化地的分布及變化見圖1。由圖1可知，煙葉經(jīng)過一段時間的醇化后，除曲靖和楚雄兩地在醇化9個月后煙葉葉面真菌數(shù)量非常接近外，各醇化地煙葉葉面真菌數(shù)量差異較大，但總體而言，在各個醇化時間點都是元江煙葉葉面的真菌數(shù)量低于其他3個醇化地（醇化17個月后略高于彌勒）。且除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個月時有所上升外，各醇化地煙葉葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時間的延長而降低。

2.2煙葉葉面可培養(yǎng)真菌種類及其動態(tài)變化

如表1所示，本試驗共鑒定出真菌24個屬（種），目前仍有4類真菌無法確定其種屬，對于形態(tài)學難鑒定的菌株，其代表性菌株的分子鑒定結(jié)果見表2。由表1可知，在各個醇化時間點，不同醇化地煙葉葉面真菌的種類各不相同。如醇化6個月時，彌勒煙葉葉面有球毛殼菌（Chaetomium globosum）、Cercophora samala、Myrmaecium rubricosum和小不整球殼屬真菌（Plectosphaerella spp.），但其他3個醇化地煙葉葉面則無：醇化9個月時，楚雄煙葉葉面有青霉屬真菌Penicillium spp.）、Teratosphaeriamolleriana和Coprinops&lagopus，但其他3個醇化地的煙葉葉面則無。

而同一醇化地在各個醇化時間點，其煙葉葉面真菌的種類也不同。如彌勒煙葉醇化6個月時出現(xiàn)小不整球殼屬真菌、醇化17個月時出現(xiàn)Coniochaeta velutina。同樣，曲靖煙葉醇化9個月時出現(xiàn)小毛克孢屬真菌（Chaetomella spp.）、醇化17個月時出現(xiàn)枝孢屬真菌（Cladosporium spp.）、球毛殼菌及Chaetomium elatum，而在其他時期卻未檢測到其存在。

在醇化剛開始時（0個月），各樣品中只檢測到根霉屬真菌及黑附球菌，但隨著醇化時間的延長，根霉屬真菌的數(shù)量不斷減少，其他真菌逐漸出現(xiàn)，煙葉葉面真菌種類不斷增加。而4個醇化地在相同的醇化時間點，其煙葉葉面真菌的種類數(shù)目也不同，具體如下：醇化6個月時，彌勒真菌種類>元江>楚雄>曲靖；醇化9個月時，楚雄>彌勒>曲靖>元江：醇化15個月時，元江>彌勒>楚雄和曲靖（兩地一樣多）：而醇化17個月時，曲靖>元江>楚雄和彌勒（兩地相同），未呈現(xiàn)任何規(guī)律性。

2.3不同地點優(yōu)勢菌群及其比例

不同地點優(yōu)勢菌群及其比例見圖2。隨著醇化時間的延長，各醇化地的優(yōu)勢菌群不斷發(fā)生變化。如彌勒煙葉醇化0個月及9個月時優(yōu)勢菌只有根霉屬真菌，所占比例分別為99.2%、96%，醇化6個月時優(yōu)勢菌有根霉屬真菌和Chaetomium屬真菌，所占比例分別為87%、6.45%，15個月時有根霉屬真菌、枝孢屬真菌和Sarocladium屬真菌，所占比例分別為74.4%、7%及4.65%，17個月時有根霉屬真菌和Coniochaeta velutina，所占比例分別為73.7%、10.52%。同樣，元江煙葉醇化0個月、6個月及9個月時優(yōu)勢菌均只有根霉屬真菌，所占比例分別為99.2%、93.5%及96%，而醇化1 5個月時有根霉屬真菌、青霉屬真菌、Cercophora屬真菌及枝頂孢霉屬真菌（Acremonium spp.），所占比例分別為20.8%、12.5%、12.5%及12.5%，醇化17個月時，有根霉屬真菌、青霉屬真菌、枝孢屬真菌及鐮刀菌屬真菌（FusaHum spp.），所占比例分別為60.9%，8.7%，8.7%及8.7%。

各醇化地在相同的醇化時間點，其煙葉葉面真菌優(yōu)勢菌群不同，但根霉屬真菌始終是各醇化地、各醇化時間點的絕對優(yōu)勢類群。而青霉屬真菌、曲霉屬真菌、鐮刀菌屬真菌、屬真菌、Myrmaecium rubricosum和枝孢屬真菌在煙葉醇化過程中也十分普遍，但不同醇化地、不同醇化時間點其優(yōu)勢各異。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)云南復烤煙葉（紅大）在醇化6個月后，云南楚雄和曲靖兩地煙葉葉面真菌數(shù)量非常接近，與彌勒和元江存在較大差異。總體而言，元江醇化煙葉葉面真菌數(shù)量最少。除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個月時有所上升外，各醇化地葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時間的延長而降低。醇化過程中4地煙葉葉面真菌數(shù)量、種類及優(yōu)勢菌群不同，可能與楚雄、彌勒、曲靖、元江4個醇化地的環(huán)境差異（年均溫、濕度等）有關(guān)：曲靖和楚雄年均溫濕度比較接近，與彌勒及元江差異較大，彌勒年均濕度最高，高達到73.3%，元江年均溫度最高，高達24.4℃。這與以往的報道一致，即醇化煙葉葉面微生物的數(shù)量和種類與發(fā)酵條件密切相關(guān)。而隨著醇化的進行，真菌數(shù)量不斷減少、種類及優(yōu)勢菌群不斷發(fā)生變化，可能與醇化時間有關(guān)。醇化初期煙葉葉面營養(yǎng)物質(zhì)豐富，葉面殘留及環(huán)境中的微生物在葉面大量生長，葉面微生物數(shù)量較多，隨著醇化的進行，煙葉含水量降低，葉面營養(yǎng)物質(zhì)減少，微生物生長受限，且微生物間存在拮抗作用，相互抑制而使其數(shù)量逐漸減少，種類及優(yōu)勢菌群也不斷發(fā)生變化。楊金奎等也發(fā)現(xiàn)醇化煙葉表面可培養(yǎng)微生物的數(shù)量隨著醇化時間的延長呈明顯的下降趨勢，而種類也在不斷變化。同樣，韓錦峰等、段焰青等、趙銘欽等及朱大恒等也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。

根霉屬真菌是本研究中的絕對優(yōu)勢菌群。余玉莎等發(fā)現(xiàn)米根霉TZK-1能夠發(fā)酵煙末增加煙葉致香成分，同時，在煙葉醇化過程中，根霉屬真菌也有可能引起煙葉霉變。因此，本研究表明，根霉屬真菌在云南彌勒、曲靖、元江、楚雄4個煙葉醇化地的各個醇化時期均為優(yōu)勢菌群之一，其數(shù)量及動態(tài)變化在云南紅大煙葉醇化品質(zhì)方面應(yīng)該發(fā)揮著極其重要的作用，值得進一步深入研究。

4結(jié)論

本研究表明，醇化過程中，不同醇化地煙葉葉面真菌數(shù)量均隨著醇化時間的延長而不斷下降，而真菌種類有所增加。不同醇化地點同一醇化時間及同一醇化地點不同醇化時間，其煙葉葉面真菌數(shù)量、種類及優(yōu)勢菌群不同。根霉屬真菌在各醇化時期及各醇化地均為優(yōu)勢菌群，前期占比90%以上：隨著醇化時間延長，青霉屬真菌、枝孢屬真菌及Chaetomium屬真菌等種類出現(xiàn)且比例有所增加。微生物數(shù)量及動態(tài)變化在云南紅大煙葉醇化品質(zhì)方面的作用值得進一步深入研究。