楊德廉 李祥英 馬夙靜 趙文超 王大海 管恩森 張英華 孟慶宏 劉振宇

摘要：為實(shí)現(xiàn)煙田土壤保育的目標(biāo)，對(duì)長(zhǎng)年連作的煙田施用有機(jī)肥，采用高通量測(cè)序技術(shù)，應(yīng)用Solexa基因組分析平臺(tái)，測(cè)定和分析復(fù)合有機(jī)肥OFN、OFJ和煙草秸稈有機(jī)肥TS對(duì)煙田土壤細(xì)菌多態(tài)性的影響。結(jié)果表明，相對(duì)于單施化肥，煙田施用有機(jī)肥后，煙田土壤細(xì)菌OTU、chaol指數(shù)和ace指數(shù)增大，表明有機(jī)肥提高了煙田土壤細(xì)菌物種豐富度：細(xì)菌豐富度因有機(jī)肥種類(lèi)而不同，并隨煙草發(fā)育期而產(chǎn)生差異。有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響顯著，在門(mén)和屬的分類(lèi)水平上，土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)和比例產(chǎn)生明顯改變，特別是有機(jī)肥處理可顯著提高假絲酵母屬細(xì)菌的豐度，而降低紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬細(xì)菌的豐度。KEGG代謝途徑差異分析發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥后土壤細(xì)菌代謝路徑和代謝路徑中基因數(shù)量發(fā)生改變，而改變了煙田土壤細(xì)菌群落功能和細(xì)菌代謝?？傊?，煙田施用有機(jī)肥改變了土壤細(xì)菌的多態(tài)性，并可能達(dá)到煙田土壤保育的效果。

關(guān)鍵詞：煙田；有機(jī)肥；土壤細(xì)菌；細(xì)菌多態(tài)性；土壤保育

煙草生產(chǎn)中存在長(zhǎng)期連作且偏重施用化學(xué)肥料的現(xiàn)象，導(dǎo)致土層板結(jié)，肥力下降，土壤微生物多樣性減少，微生物種群趨向單一。土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，質(zhì)量好的土壤微生物多態(tài)性結(jié)構(gòu)合理，對(duì)土壤有機(jī)物分解、腐殖質(zhì)增加、團(tuán)粒結(jié)構(gòu)形成、速效養(yǎng)分釋放和累積、土壤結(jié)構(gòu)改善具有重要意義。土壤微生物多態(tài)性反映土壤微生物在其物種豐富度及其種間差異，從一個(gè)側(cè)面反映了其群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量重要指標(biāo)。

施用有機(jī)肥是土壤改良的重要手段。研究表明有機(jī)肥對(duì)良好的土壤結(jié)構(gòu)有著促進(jìn)作用，可提高土壤的pH值、速效養(yǎng)分的含量，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。有機(jī)肥中含有大量易被微生物分解利用的物質(zhì)，可以刺激微生物迅速生長(zhǎng)增殖，顯著增加土壤微生物生物量，提高土壤微生物中碳、氮含量以及土壤酶活性，影響土壤微生物多態(tài)性。

本研究選取了兩種復(fù)合有機(jī)肥和煙草秸稈有機(jī)肥施用于連作煙田，采用高通量測(cè)序的方法，探討施用有機(jī)肥后連作煙田土壤細(xì)菌多態(tài)性特征，以明確不同有機(jī)肥對(duì)土壤的改良作用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年在山東諸城煙草試驗(yàn)站開(kāi)展。試驗(yàn)站位于山東省諸城市賈悅鎮(zhèn)瑯埠村，土壤類(lèi)型為褐土，土壤基本養(yǎng)分狀況為：pH 6.25，有機(jī)質(zhì)15.17 g/kg、全氮636.0 mg/kg、堿解氮63.07 mg/kg、速效磷30.23 mg/kg、速效鉀254.66 mg/kg、水溶性氯28.87 mg/kg、交換性鈣6455.78 mg/kg、交換性鎂118.59 mg/kg。該煙田多年連作，長(zhǎng)年單一施用化學(xué)肥料。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用大田試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)有機(jī)肥處理，以單施化肥作為對(duì)照，共4個(gè)處理，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)×寬為50 mX6.6 m，以110 cmX55 cm株行距種植煙草6行。供試煙草品種為NC55。具體施肥方案設(shè)置如表1：各肥料中養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表2。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1土壤取樣方法在煙草平預(yù)期、采烤前期、采烤后期3個(gè)時(shí)期，沿每個(gè)處理的中間兩行煙壟，按“S”型方法在小區(qū)的5m、25m、45m處進(jìn)行土壤取樣。選取健康煙株，在距煙草根莖15-20cm處，取10-20cm深度土壤。每個(gè)小區(qū)取3個(gè)樣，每個(gè)處理共取9個(gè)樣品，用無(wú)菌樣品袋保存，冰盒攜帶，放入-70℃冰箱保存，備用。

1.3.2土壤總DNA的提取和高通量測(cè)序DNA提取前將每個(gè)處理的9個(gè)樣品充分混勻?yàn)橐粋€(gè)混合樣，4個(gè)處理的3次取樣共混合為12個(gè)樣品，采用Omega試劑盒提取土壤DNA，樣品檢測(cè)合格后，應(yīng)用Solexa基因組分析平臺(tái)進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，測(cè)序?yàn)榧?xì)菌16S rDNA的v3-v4雙可變區(qū)域。

1.3.3測(cè)序結(jié)果分析將原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除接頭序列，并將雙端測(cè)序序列進(jìn)行拼接成單條序列。對(duì)每個(gè)樣板庫(kù)的單序列基于GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)，使用QIIME（version 1.8.0）工具包進(jìn)行注釋?zhuān)凑?7%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU（0perational Taxonomic Units），每一個(gè)OTU通常被視為一個(gè)微生物物種，并對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行豐富度指數(shù)計(jì)算、PCA（Princjpal Component Analysis）差異性分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）構(gòu)成差異分析。

2結(jié)果

2.1有機(jī)肥對(duì)煙田土壤細(xì)菌群落豐富度的影響

從12個(gè)土壤樣品中共獲得1167815條原始序列，比較分析得到145 262個(gè)OTU，樣品文庫(kù)的覆蓋率均大于等于0.89（表3），本次測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及真實(shí)性較高，可客觀(guān)反映土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)及差異性特征。結(jié)合OTU和群落豐富度指數(shù)chaol、ace可見(jiàn)，在煙草的3個(gè)生長(zhǎng)期，煙田施加有機(jī)肥可不同程度的改變煙田土壤細(xì)菌的物種多樣性和群落豐富度：在平預(yù)期，以施用復(fù)合有機(jī)肥OFJ處理的OTU和群落豐富度指數(shù)chaol、ace最高，相較于單施化肥分別提高了14.80%、19.71%、18.17%：在采烤前期，以復(fù)合有機(jī)肥OFN影響最為明顯，相較于單施化肥OTU和群落豐富度指數(shù)chaol、ace分別提高了37.26%、35.26%、38.16%：在采烤后期，施用煙草秸稈有機(jī)肥的TS處理土壤細(xì)菌的群落豐富度指數(shù)chaol、ace最高，但OTU略低，而復(fù)合有機(jī)肥OFJ處理土壤細(xì)菌OTU最高?？梢?jiàn)，土壤中施用有機(jī)肥較單施化肥提高了土壤細(xì)菌多樣性和豐富度，不同有機(jī)肥和不同煙草生長(zhǎng)期，這種效應(yīng)表現(xiàn)有差異。

2.2有機(jī)肥對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

測(cè)序發(fā)現(xiàn)，供試3個(gè)有機(jī)肥和單施化肥的處理，其土壤細(xì)菌豐度前10個(gè)門(mén)均為：酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、擬桿菌門(mén)（Baeteroidetes）、TM7、WS3（圖1）。在平預(yù)期，3種有機(jī)肥處理土壤中豐度位于前10的土壤細(xì)菌門(mén)中有8個(gè)門(mén)細(xì)菌豐度均較單施化肥處理提高，硝化螺旋菌門(mén)豐度均下降，細(xì)菌放線(xiàn)菌門(mén)豐度OFN、OFJ處理分別較單施化肥處理提高了34.48%、3.27%，但煙草秸稈有機(jī)肥TS處理則降低了9.69%。采烤前期，相較于單施化肥，OFN處理中位于前10位的細(xì)菌門(mén)豐度均提高，其中以TM7、WS3的豐度提升很大，分別為229.41%、244.00%，OFJ處理硝化螺旋菌門(mén)較單施化肥下降39.86%，TS處理酸桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)分別降低了1.05%、51.35%。在采烤后期，3種有機(jī)肥處理的土壤細(xì)菌在門(mén)水平上豐度下降，其中OFN處理的酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)豐度下降，OFJ處理的酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)豐度下降，TS處理的酸桿菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)豐度下降。可見(jiàn)在門(mén)分類(lèi)水平上，施用有機(jī)肥能夠引起土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的明顯變化。

經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，土壤樣品中細(xì)菌豐度比例最高的前10個(gè)屬為：Kaistobacter.鏈霉菌屬、紅游動(dòng)菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬、假絲酵母菌屬紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬、韓國(guó)生工菌屬、及Steroidobacter（圖2）。在平預(yù)期，OFN處理土壤細(xì)菌豐度位于前10個(gè)屬中8個(gè)屬豐度較對(duì)照提高，其中假絲酵母菌屬提高最大，相較于單施化肥提高848.13%，紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬豐度下降；OFJ和TS處理土壤細(xì)菌豐度位于前10個(gè)屬中的7個(gè)屬豐度較對(duì)照提高，其中假絲酵母菌屬提高最大，分別提升了1505.73%和669.71%，該兩種有機(jī)肥除同樣使紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬豐度下降外，還使Steroidobacter豐度下降。在采烤前期，OFN處理的土壤細(xì)菌豐度位于10的屬細(xì)菌豐度均較對(duì)照提高，OFJ和TS處理細(xì)菌的細(xì)菌豐度變化趨勢(shì)同平頂期一致，同樣，3種有機(jī)肥處理對(duì)假絲酵母菌屬豐度提升最大。在采烤后期，TS處理的土壤細(xì)菌豐度變化特征與前兩個(gè)時(shí)期一致，OFJ處理中的紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬豐度較對(duì)照提高，OFN處理的Kaistobacter.紅游動(dòng)菌屬、假絲酵母菌屬豐度提高，其他豐度下降。

2.3不同施肥處理間PCA差異顯著性分析

對(duì)12個(gè)土壤樣品中OTU組成進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，3種有機(jī)肥處理與單施化肥處理距離較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出有機(jī)肥處理與單施化肥處理在OTU組成上的較大差異，而有機(jī)肥處理間差異較?。簾煵萁斩捰袡C(jī)肥TS與復(fù)合有機(jī)肥OFJ處理的土壤細(xì)菌OTU組成差異較小，與復(fù)合有機(jī)肥OFN處理差異較大。圖中也顯示，TS、OFJ、單施化肥處理的土壤細(xì)菌OTU組成在3個(gè)煙草生育期之間差異較小，但OFN處理的則較大?？傮w表明，煙田施用有機(jī)肥，顯著改變了土壤細(xì)菌OTU組成特征。

2.4 KEGG代謝途徑第二層分類(lèi)差異分析

基于KEGG代謝途徑第二等級(jí)對(duì)有機(jī)肥施用后土壤細(xì)菌群落功能的差異進(jìn)行預(yù)測(cè)，由圖4可見(jiàn)，不同分組的樣品之間在微生物群落功能基因在代謝途徑上存在差異，不同路徑基因所占比例的大小不同。相較于單施化肥，煙田施用有機(jī)肥OFN后，土壤細(xì)菌在基于KEGG代謝途徑有5個(gè)途徑存在顯著差異，其中Translation和Immune System Diseases途徑基因數(shù)量顯著提高，而Transcription relatedproteins和Electron transfer carriers途徑基因數(shù)量降低。而有機(jī)肥施用OFJ則引起Transport andCatabolism.Metabolism of Cofaetors and Vitamins、Endocrine System.Function unknown等代謝途徑基因數(shù)量顯著提高，其中Nucleotide metabolism、Transcription related proteins、Metabolism ofCofactors and Vitamins途徑的基因數(shù)量顯著降低。煙草秸稈有機(jī)肥TS施入后，引起Translation途徑基因數(shù)量量顯著增加，Metabolism of Cofactors andVitamins途徑的基因數(shù)量顯著降低?？梢?jiàn)，有機(jī)肥處理使煙田土壤細(xì)菌群落功能和代謝產(chǎn)生改變，不同有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌代謝路徑和代謝路徑中基因數(shù)量的改變效應(yīng)表現(xiàn)不同。

3討論

土壤細(xì)菌多態(tài)性是土壤質(zhì)量的綜合體現(xiàn)，本研究揭示出不同有機(jī)肥均可明顯提高土壤細(xì)菌的數(shù)量和多樣性，這跟毛君杰等、徐永剛等發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥提高煙田以及其他作物土壤細(xì)菌的表現(xiàn)一致。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌的作用效果跟煙草生育期有一定關(guān)系，復(fù)合有機(jī)肥OFJ和OFN可明顯提高煙田土壤細(xì)菌在平頂期或采烤前期的OTU和chaol、ace指數(shù)，而煙草秸稈有機(jī)肥則在采烤后期明顯提高土壤細(xì)菌chaol、ace指數(shù)。研究表明，有機(jī)肥施用可影響土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，調(diào)整土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。袁銘章等研究揭示秸稈有機(jī)肥增強(qiáng)了土壤酶活性，有利于土壤細(xì)菌群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高：張?jiān)苽サ劝l(fā)現(xiàn)有機(jī)肥顯著提高了烤煙根際的細(xì)菌數(shù)量和微生物總量，以及烤煙根際放線(xiàn)菌的數(shù)量。本研究結(jié)果顯示，OFN、OFJ和TS3種供試有機(jī)肥處理較單施化肥對(duì)土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬均產(chǎn)生較大影響：3種供試有機(jī)肥可提高多數(shù)細(xì)菌的豐度，但會(huì)降低紅色桿菌屬和硝化螺旋菌屬的豐度。本研究基于KEGG代謝途徑的預(yù)測(cè)差異分析，也揭示3種有機(jī)肥的施用影響了土壤細(xì)菌的功能菌群。

本試驗(yàn)證明煙田施用有機(jī)肥能夠改善煙田土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，對(duì)煙田土壤保育的理論和實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義，但需要進(jìn)一步深入探究土壤細(xì)菌響應(yīng)有機(jī)肥的詳細(xì)機(jī)制，更加科學(xué)利用有機(jī)肥進(jìn)行土壤保育。

4結(jié)論

煙田施用有機(jī)肥，可明顯改變煙田土壤細(xì)菌多態(tài)性，明顯優(yōu)于單一施用化肥。有機(jī)肥的種類(lèi)對(duì)煙田土壤細(xì)菌的數(shù)量及物種豐富度、在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌的影響不同，顯示出有機(jī)肥種類(lèi)在土壤改良效應(yīng)上的不同。在煙草的不同生育期，有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌多態(tài)性的影響表現(xiàn)有差異，不同有機(jī)肥的作用效果呈現(xiàn)不一樣的規(guī)律，顯示出土壤細(xì)菌響應(yīng)有機(jī)肥的作用機(jī)制差異，和“土壤一土壤細(xì)菌一煙草”體系對(duì)有機(jī)肥存在整體動(dòng)態(tài)響應(yīng)?？傊?，有機(jī)肥能夠改變土壤細(xì)菌多態(tài)性，對(duì)維持煙田土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡，實(shí)現(xiàn)煙田土壤保育有重要作用。