李盼盼 李方明 申國明 高林 余軍 鄭璇 張鵬

摘要：為研究環(huán)境生態(tài)因素對煙草內(nèi)生真菌的影響，在湖北省恩施州選取不同有機質(zhì)含量和酸堿度的田塊，以云煙87為供試植株，探究土壤有機質(zhì)含量和酸堿度對煙草內(nèi)生真菌生物多樣性的影響。試驗分別選取6塊不同有機質(zhì)含量（分別為16.3，20.7，233，27.1，31.4和35.6 g/kg及4塊不同pH（分別為4.3，5.5，6.4和7.6）的田塊，采用五點取樣法采集健康煙草植株，分離純化根中內(nèi)生真菌并根據(jù)rDNA-ITS序列分析進行菌種鑒定，以Shannon多樣性指數(shù)及相對分離頻率反映內(nèi)生真菌生物多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草內(nèi)生真菌生物多樣性隨土壤有機質(zhì)含量的升高呈先上升后下降的趨勢，在6個不同土壤有機質(zhì)含量下，內(nèi)生真菌shannon多樣性指數(shù)分別為0.53、0.67、0.82、1.09、0.86和0.59：而煙草內(nèi)生真菌生物多樣性隨土壤pH的升高呈下降的趨勢，在4個不同土壤pH下，內(nèi)生真菌Shannon多樣性指數(shù)分別為1.36、1.12、0.93和0.83。研究表明，土壤有機質(zhì)含量和酸堿度會對煙草內(nèi)生真菌生物多樣性產(chǎn)生一定影響。在一定范圍內(nèi)，土壤有機質(zhì)含量的升高或者pH的降低可以增加煙草內(nèi)生真菌的物種豐富度。

關(guān)鍵詞：土壤；有機質(zhì)：酸堿度：煙草內(nèi)生真菌；生物多樣性

煙草內(nèi)生真菌（Tobacco endophytic fungi）是定殖于煙草組織內(nèi)部，不會引起煙草產(chǎn)生明顯病害或者不良影響的一類真菌。煙草內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性，其在與宿主植物煙草的協(xié)同進化過程中建立了互利共生關(guān)系，對煙草的生長、固氮、抗病害等發(fā)揮著重要作用。植物內(nèi)生真菌的來源途徑之一是根際微生物通過植物側(cè)根的裂縫進入植物體內(nèi)。土壤是根生長發(fā)育的必要環(huán)境，而其理化性質(zhì)特別是有機質(zhì)含量和酸堿度對根際土壤中微生物的生物活性及多樣性有重要影響。焦曉光等發(fā)現(xiàn)土壤有機質(zhì)含量最高的農(nóng)田黑土微生物群落的豐度、多樣性和均勻性指數(shù)最高。在外界環(huán)境一致的條件下，農(nóng)田黑土有機質(zhì)含量不同可影響土壤微生物群落的代謝能力。米亮通過對4個不同有機質(zhì)含量的黑土微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能多樣性進行比較，從而解析了有機質(zhì)含量對黑土微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能及作物根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。孫冰潔等綜述了農(nóng)田土壤物理性質(zhì)（密度、孔隙、水分、溫度）及化學性質(zhì)（土壤pH、土壤有機質(zhì)）對土壤微生物群落的影響。由上推測，土壤的理化性質(zhì)及生態(tài)環(huán)境因子會通過影響煙草根際土壤微生物從而對煙草內(nèi)生真菌的多樣性及分布產(chǎn)生一定影響，但目前還沒有關(guān)于土壤有機質(zhì)含量和酸堿度對煙草內(nèi)生真菌生物多樣性影響的相關(guān)報道。

生物多樣性的研究對于認識生物群體的結(jié)構(gòu)及功能、行為和生活史，以及他們與人類生存環(huán)境的關(guān)系，科學有效地開發(fā)利用生物資源具有十分重要的意義。煙草內(nèi)生真菌是煙田微生物生態(tài)系統(tǒng)重要的一個類群，開展煙草內(nèi)生真菌種群多樣性的研究不僅可以在群體水平上揭示其空間、地理區(qū)域分布的動態(tài)變化規(guī)律，構(gòu)建煙草內(nèi)生真菌研究的基礎(chǔ)理論與基本方法，也為以后更深入的研究與資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

恩施州位于湖北省西南部，氣候、土壤條件優(yōu)良，煙草種植歷史悠久。研究表明，恩施州土壤養(yǎng)分含量分布極不均衡，各植煙點間的養(yǎng)分含量差異較大：土壤有機質(zhì)的范圍為2.8-43.8 g/kg，土壤pH值范圍為4.1-7.9。本研究利用湖北恩施土壤有機質(zhì)含量、酸堿度范圍廣的特點，探究土壤有機質(zhì)含量和酸堿度對煙草內(nèi)生真菌生物多樣性影響，以期找到土壤有機質(zhì)含量、酸堿度和煙草內(nèi)生真菌多樣性之間的關(guān)系，為系統(tǒng)構(gòu)建土壤理化性質(zhì)一煙草內(nèi)生真菌多樣性研究體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗田塊選擇及樣品采集

在參考已有試驗研究的基礎(chǔ)上，于湖北恩施州望城坡和城郊煙站，測定并選擇6塊土壤有機質(zhì)含量分別為16.3，20.7，23.3，27.1，31.4和35.6g/kg，但其他理化性質(zhì)差異不顯著的田塊：選擇4塊土壤pH分別為4.3，5.5，6.4和7.6，但其他理化性質(zhì)差異不顯著的田塊進行煙株根系樣品的采集。于2017年5-8月，采用五點取樣法采集健康煙株的根部（主根，地下約5cm處），然后帶回實驗室4℃保存，并在24h內(nèi)處理完畢。

1.2煙草內(nèi)生真菌的分離

將采集的根部樣品在自來水下充分沖洗，除去表面的泥土。表面滅菌采取如下步驟：75%乙醇消毒1 min：2.5%次氯酸鈉消毒30 s：75%乙醇消毒1min：然后用無菌水漂洗3遍。將滅菌的根部組織切塊，將切口插入PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～7d。待培養(yǎng)基中切口處有菌絲長出，挑取菌絲至新的PDA培養(yǎng)基上，劃線稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)。試驗設(shè)置未經(jīng)表面滅菌的組織作為對照，并通過漂洗液檢驗法和組織印跡法來檢驗表面滅菌效果。

1.3內(nèi)生真菌的分類鑒定

采用CTAB法提取分離的內(nèi)生真菌基因組DNA。利用通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增。擴增成功的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。通過BLAST序列比對，最終確定菌株的分類地位。

1.4數(shù)據(jù)分析

以香農(nóng)多樣性指數(shù)（shannon's diversity index，H）來反映煙草內(nèi)生真菌的生物多樣性，用相對分離頻率衡量某種內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度，用Sorenson相似性系數(shù)Cs來分析煙草內(nèi)生真菌菌群組成的相似程度。其公式分別為：

其中，K為煙草內(nèi)生真菌種類的總數(shù)，P為某種煙草內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)的百分數(shù)。

相對分離頻率（%）=某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/全部內(nèi)生真菌總菌株數(shù)

（2）

其中，相對分離頻率（RF）≥10%的內(nèi)生真菌為優(yōu)勢菌，RF≥1%的內(nèi)生真菌為常見菌，RF<1%的為稀有菌。

其中，為兩個土壤有機質(zhì)含量或pH值下煙草樣品中共有的內(nèi)生真菌屬數(shù)，a為某一土壤有機質(zhì)含量或pH值下煙草樣品中內(nèi)生真菌屬數(shù)，b為另一土壤酸堿度或pH下煙草樣品中內(nèi)生真菌屬數(shù)。

2結(jié)果

2.1不同土壤有機質(zhì)含量下煙草內(nèi)生真菌的多樣性

在6個土壤有機質(zhì)含量下采集的健康煙株根系中共分離到278株內(nèi)生真菌（表1），鑒定為34屬，Shannon多樣性指數(shù)為4.56。6個有機質(zhì)含量下分別分離到15、19、22、28、23和18屬，Shannon多樣性指數(shù)分別為0.53、0.67、0.82、1.09、0.86和0.59。根據(jù)菌株的相對分離頻率，優(yōu)勢菌群為曲霉屬Aspergillus，其相對分離頻率為1 8.35%。常見菌群為23屬，分別為刺盤孢屬Colletotrichum、莖點霉屬Phoma、鏈格孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium、彎孢屬Curvularia、附球菌屬Epicoccum、鐮孢屬Fusarium、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、踝節(jié)菌屬Talaromyces、黑孢屬Nigrospora、蔓枯病屬、球座菌屬Guignardia、木霉屬、毛殼屬、小叢殼屬、白粉寄生孢、毛霉屬、棒孢屬、端梗孢屬Acrophialophora、新薩托屬Neosartorya、葉點霉屬Phyllosticta、梭孢殼屬Thielavia和枝孢屬Cladosporium。稀有菌群為10屬，分別為派倫霉屬Peyronellaea、角擔菌屬Ceratobasidium、松球殼孢菌、雙極霉屬Bipolaris、耐堿酵母屬Galactomyces、炭角菌屬Xylariaceae、擬青霉屬Paecilomyces、并頭狀菌屬Syncephalastrum、旋孢腔屬CochBobolus、被孢霉屬Mortierella。其中，耐堿酵母屬和并頭狀菌屬只在有機質(zhì)含量為27.1 g/kg的根系中分離到，旋孢腔屬和被孢霉屬只在有機質(zhì)含量為31.4g/kg的根系中分離到，派倫霉屬、松球殼孢菌、炭角菌屬、角擔菌屬分別只在有機質(zhì)含量為16.3、20.7、23.3、35.6 g/kg的根系中分離到。由此可見，煙草內(nèi)生真菌的多樣性隨著土壤有機質(zhì)含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且部分菌株只在特定的土壤有機質(zhì)含量下被分離到，表現(xiàn)出?；浴?/p>

2.2不同土壤酸堿度下煙草內(nèi)生真菌的多樣性

在4個土壤pH值下采集的健康煙株根系中共分離到內(nèi)生真菌215株，鑒定為32屬，Shannon多樣性指數(shù)為4.23。土壤pH值4.4、5.5、6.4、7.6下分別分離到29、25、22和18屬，Shannon多樣性指數(shù)分別為1.36、1.12、0.93和0.83。根據(jù)菌株的相對分離頻率，曲霉屬Aspergillus為優(yōu)勢菌群，其相對分離頻率為16.74%。常見菌群為20屬，分別為刺盤孢屬Colletotrichum、莖點霉屬Phoma、鏈格孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium、彎孢屬Curvularia、附球菌屬Epicoccum、鐮孢屬Fusarium、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、踝節(jié)菌屬Talaromyces、黑孢屬Nigrospora、蔓枯病屬Didymella、球座菌屬Guignardia、木霉屬Trichoderma、小叢殼屬Glomerella、雙極霉屬Bipolaris、毛霉屬Rhizomucor.擬青霉屬Paecilomyces、新薩托屬Neosartorya、葉點霉屬Phyllosticta、梭孢殼屬Thielavia。稀有菌群為11屬，分別為毛殼屬Chaetomium、派倫霉屬Peyronellaea、小光殼屬Leptosphaerulina、半內(nèi)果菌屬Hamigera、白粉寄生孢Ampelomyces、松球殼孢菌、棒孢屬Corynespora、端梗孢屬Acrophialophora、Setophoma（尚未中文命名）、并頭狀菌屬、枝孢屬Cladosporium（圖1）。其中，半內(nèi)果菌屬、Setophoma只在土壤pH為4.4的煙株根系中分離到，端梗孢屬、枝孢屬、派倫霉屬分別只在土壤pH為5.5、6.4、7.6的煙株根系中分離到。由此可見，煙草內(nèi)生真菌的多樣性隨著土壤pH值的升高呈現(xiàn)下降的趨勢，并且部分菌株同樣表現(xiàn)出?；?。

2.3不同土壤有機質(zhì)含量和酸堿度下煙草內(nèi)生真菌菌群組成的相似性

由表2可見，不同土壤有機質(zhì)含量下煙草內(nèi)生真菌組成的相似性系數(shù)介于0.61～0.84，含量16.3g/kg的菌群組成與35.6 eCkg的菌群組成相似性系數(shù)最低，為0.61：而有機質(zhì)含量為23.3 g/kg的菌群組成與27.1 g&g的相似性系數(shù)最高，為0.84。不同土壤pH下（表3）煙草內(nèi)生真菌組成的相似性系數(shù)介于0.70～0.89，土壤pH5.5和6.4時的菌群組成與7.6時的菌群組成相似性系數(shù)均為0.70，而土壤pH 4.4時的菌群組成與5.5時的菌群組成相似性系數(shù)最高，為0.89。總體而言，不同有機質(zhì)含量和酸堿度下煙草內(nèi)生真菌的菌群組成相似性較高。

3討論

本研究選擇6個不同有機質(zhì)含量和4個不同酸堿度的田塊采集健康煙株的根系組織，進行內(nèi)生真菌的分離、純化和鑒定。Shannon多樣性指數(shù)表明，煙草內(nèi)生真菌的多樣性隨著土壤有機質(zhì)含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而隨著土壤pH的升高呈現(xiàn)下降的趨勢。植物內(nèi)生真菌的來源途徑之一是根際微生物，土壤環(huán)境會對根際真菌的定殖產(chǎn)生重要影響，因此土壤環(huán)境也會對根中的內(nèi)生真菌產(chǎn)生一定的間接影響。周奇研究發(fā)現(xiàn)，根際真菌豐富度和多樣性指數(shù)均與土壤有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。隨著土壤有機質(zhì)含量的升高，根際真菌的菌群多樣性逐步增加。但在本試驗選取的土壤有機質(zhì)含量范圍內(nèi)，煙草內(nèi)生真菌的物種多樣性沒有隨著土壤有機質(zhì)含量的上升呈現(xiàn)上升的趨勢，而是呈先上升后下降的趨勢，原因可能是適宜煙株生長的土壤有機質(zhì)含量為20 g/kg左右，有機質(zhì)含量過高違背煙草的需肥規(guī)律，不利于煙株的生長發(fā)育。當土壤有機質(zhì)含量超過30 g/kg，煙株根系生長發(fā)育不良，不利于根際微生物的進入。研究顯示，土壤pH可以改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)，真菌數(shù)量與土壤pH呈負相關(guān)性。本試驗中，隨著土壤pH的升高，煙草內(nèi)生真菌的多樣性呈現(xiàn)下降的趨勢。由此可見，土壤堿度升高會降低煙草內(nèi)生真菌的多樣性。

在土壤不同的有機質(zhì)含量和酸堿度下，煙草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群均為曲霉屬Aspergillus，可能是由于土壤中曲霉屬真菌受土壤有機質(zhì)含量和酸堿度變化的影響較小，且在所有根際真菌中處于主導地位：也可能是與其他根際真菌相比，曲霉屬真菌對煙草根系的侵染能力較強。并且，本試驗發(fā)現(xiàn)煙草內(nèi)生真菌表現(xiàn)出土壤理化性質(zhì)專化性，即在某一特定的土壤有機質(zhì)含量和酸堿度下，均有特定屬出現(xiàn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，煙草內(nèi)生真菌具有組織?；?，可能是由根、莖、葉的生態(tài)位不同造成的。內(nèi)生真菌的土壤理化性質(zhì)?；?，可能是因為有機質(zhì)含量和酸堿度的變化導致根際真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，某些真菌只有在特定的土壤有機質(zhì)含量和酸堿度條件下才能生存和侵染根系。

4結(jié)論

在6個土壤有機質(zhì)含量下共分離到278株內(nèi)生真菌，鑒定為34屬。6個有機質(zhì)含量分別分離到15、19、22、28、23和18屬，Shannon多樣性指數(shù)分別為0.53、0.67、0.82、1.09、0.86、0.59。內(nèi)生真菌多樣性隨著土壤有機質(zhì)含量的升高呈先上升后下降的趨勢。在4個土壤pH值下共分離到內(nèi)生真菌215株，鑒定為32屬。土壤pH為4.4、5.5、6.4、7.6下分別分離到29、25、22和18屬，Shannon多樣性指數(shù)分別為1.36、1.12、0.93、0.83。內(nèi)生真菌多樣性隨著土壤pH的升高呈現(xiàn)下降的趨勢。煙草內(nèi)生真菌表現(xiàn)出土壤理化性質(zhì)?；?。以上研究表明，煙草內(nèi)生真菌的多樣性在一定程度上受環(huán)境生態(tài)因素的影響，而其他環(huán)境生態(tài)因素，如海拔高度、氣候條件等對煙草內(nèi)生真菌多樣性的影響同樣值得進一步探究。