常愛霞 屈亞芳 王國平 李洋洋 羅成剛 馮全福 陳志強 付憲奎 楊愛國 胡日生 向世鵬 王元英

摘要：為探索大白筋599特征香氣性狀的關鍵致香物質(zhì)基礎和分子機制，為特香型烤煙品種培育及工業(yè)利用奠定基礎，通過不同品種（系）的表面分泌物檢測及煙葉感官鑒定比較，明確大白筋599特征香氣性狀關鍵致香物質(zhì)基礎：通過對不同品種中調(diào)控關鍵致香物質(zhì)合成的基因進行測序，明確大白筋599特征香氣性狀形成的分子基礎。結(jié)果表明，烤煙品種大白筋599和香料煙品種Samsun表面分泌物中含有賴百當二萜冷杉醇，而普通烤煙G28等均不含冷杉醇。普通烤煙G28與大白筋599雜交或回交的后代品系中，含有冷杉醇的均具有大白筋599特異香氣特性，不含冷杉醇的沒有特異香氣特性。調(diào)控冷杉醇合成的關鍵基因NtCPS2的第292位堿基在不同品種間具有多態(tài)性，在大白筋599中是野生型堿基G，而在供試普通烤煙及生產(chǎn)主栽品種中是突變型堿基T。冷杉醇是烤煙品種大白筋599特異香氣性狀形成的關鍵致香物質(zhì)。調(diào)控冷杉醇合成的關鍵基因NtCPS2的第292位堿基在大白筋599及供試普通烤煙品種和主栽品種間的SNP多態(tài)性，是導致其香氣特征差異的主要原因。通過遺傳改良，豐富煙草表面分泌物中致香成分的種類和含量，是培育特色香氣風格烤煙品種的重要途徑。

關鍵詞：大白筋599；特異香型烤煙：基因NtCPS2：冷杉醇

香氣質(zhì)、香氣量和香型風格等香氣性狀是衡量煙葉和卷煙質(zhì)量的重要指標。隨著中式烤煙型卷煙的不斷發(fā)展及國際上對卷煙外源香精香料使用的限制，卷煙工業(yè)越來越需求香氣風格突出、類型多樣的高香優(yōu)質(zhì)煙葉原料。品種作為影響煙葉質(zhì)量和香氣風格特色的內(nèi)因，篩選和培育香氣品質(zhì)優(yōu)良的多類型特色烤煙品種是滿足卷煙工業(yè)原料需求的最經(jīng)濟有效的途徑。特香型烤煙品種大白筋599是我國上世紀60年代選育的農(nóng)藝性狀具有烤煙特征特性，煙葉香氣特點具有類香料煙（samsun）特征特性的烤煙品種。該品種原煙香氣質(zhì)好，香氣量足，濃度高，飄逸感強，在卷煙工業(yè)和煙草品質(zhì)育種上都具有較高的開發(fā)利用價值，但因該品種難以烘烤和感黑脛病等不利特性，以及其關鍵致香物質(zhì)基礎及分子機制尚不明確等原因，限制了其在工業(yè)和育種上的利用。因此，系統(tǒng)分析大白筋599特異香氣性狀的遺傳及致香物質(zhì)基礎，把該品種香氣性狀定向轉(zhuǎn)移到易烤抗病的優(yōu)良烤煙品種中，是加快其香氣性狀利用的重要途徑。劉洪祥等曾利用嫁接的方式證明，大白筋599特異香味的有無受接穗品種支配，主要在煙株地上部分的葉片中形成，與砧木品種無關：相關研究對其特殊香氣性狀的遺傳分析表明，其特殊香氣質(zhì)主要受單顯性基因控制，特殊香氣量可能受微效多基因調(diào)控，烤后煙葉在揮發(fā)性致香物質(zhì)的種類和含量上，大白筋599等特香型烤煙與香料煙存在著較大的差異，與烤煙差異相對較?。喝蚊竦妊芯勘砻?，大白筋599等特香型烤煙致香物質(zhì)含量特點與香料煙更接近，與烤煙差異較大：也有人對大白筋599與其他烤煙品種（系）表面分泌物總量進行了分析，但未明確不同品種間表面分泌物的成分差異。目前，導致大白筋599與其他烤煙香氣特性不同的關鍵致香物質(zhì)及分子基礎仍未知。因不同類型品種烤后煙葉致香物質(zhì)種類差異較小，而含量差異又受樣品采收、調(diào)制、等級等多種因素的影響，使得結(jié)果復雜多樣而難以確定。但烤煙大白筋599在田間即可散發(fā)特殊香氣（該品種也是通過田間聞香選育而成），所以推測其特殊香氣可能是表面分泌物中某種特殊揮發(fā)性成分或者某種致香前體物降解產(chǎn)生的揮發(fā)性成分所致。本研究擬利用特香型烤煙大白筋599、普通烤煙、香料煙、以及大白筋599與普通烤煙雜交選育的高代雜交和回交新品系材料，從鮮煙葉表面分泌物入手，探索大白筋599特異香氣性狀的關鍵致香物質(zhì)基礎和分子機制，為烤煙特異香氣性狀的育種及工業(yè)利用奠定研究基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試品種（系）為烤煙品種G28和大白筋599，香料煙品種Samsun和Basma，以及穩(wěn)定品系C01（大白筋599與G28回交BC3F5代）、C02（大白筋599與G28回交BC3F5代）和C03（大白筋599與G28雜交F6代）。其中定型品種由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草種質(zhì)資源子平臺提供，回交及雜交后代品系為課題組定向改良品系。

1.2試驗設計

試驗材料于2016年5月種植于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所即墨試驗基地，土壤類型為棕壤，堿解氮含量51.55 mg/kg，有效磷21.60 mg/kg，速效鉀131.74 mg/kg，氯離子12.40 mg/kg，有機質(zhì)0.81%，pH值5.84。試驗采取小區(qū)試驗（小區(qū)長12.5 m，行距1m，株距0.5m），每個品種（系）種植2行區(qū)。在旺長后期（現(xiàn)蕾前）取樣進行表面分泌物檢測分析。留取烤后煙葉C3F樣品進行后續(xù)感官鑒定。

1.3取樣和樣品前處理

每個品種選取9株長勢正常一致的煙株，每3株作為一個重復，共設3次重復。每一重復取樣均從單株由頂端向下數(shù)4-6葉位（長度15-20cm）各取一片煙葉，每片煙葉在靠近葉基、葉中和葉尖處用直徑16mm的打孔器各打一葉盤放入20mL提取小瓶。GC-MS檢測前的處理過程參照文獻進行。

1.4主要測定物質(zhì)

煙草表面分泌物主要包括3類成分，二萜（主要包括賴百當二萜和西柏烷二萜）、糖酯和蠟質(zhì)，其中最豐富的前兩大類成分，二萜和糖酯，與煙草香氣品質(zhì)密切相關，也是本研究檢測分析的主要物質(zhì)。煙草中賴百當二萜主要是順一冷杉醇，該物質(zhì)用標準品定性：西柏烷二萜參照行業(yè)標準《煙草及煙草制品西柏烷二萜醇測定》定性：糖酯用特征離子定性，參照蔡莉莉，SEVERSON等研究結(jié)果。各物質(zhì)利用內(nèi)標正十七烷進行相對定量。相對定量的公式為：

物質(zhì)含量（ug/c㎡）=（目標物的峰面積/內(nèi)標正十七烷峰面積）xN內(nèi)標/S葉片總面積

1.5GC-MS檢測方法

色譜柱：TR-1MS（30.0mx0.25 gmx0.25 um）：進樣口溫度：265℃：柱頭壓：100 kPa：傳輸線溫度：280℃：升溫程序：從165℃起，以4℃/min升至280℃，保持20 min：進樣量：1.0μL：分流比：15.0。GCMS-QP 2010 plus，離子源溫度：280.00℃：接口溫度：280.00℃：掃描速度：1666。檢索譜庫：NIST8S。

1.6感官鑒定方法

取烤后C3F等級煙葉制備卷煙樣品，由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所評吸委員會專家針對特異香氣性狀表現(xiàn)進行感官定性鑒定。

1.7基因克隆測序方法

以供試品種的DNA為模板，利用oligo7軟件在冷杉醇第3和第4的外顯子上設計測序引物，引物（命名為CX FCX R）序列為：上游引物CX F（GATCACTCAAAAAACTCCGAA），下游引物CX R：（TTGTTTCTCTTATGAAGGCAC）。

2結(jié)果

2.1冷杉醇特征色譜峰的確定

如圖1所示，由空白硅烷化試劑（圖1a）及冷杉醇標準品硅烷化后的色譜圖（圖1b）對比可得，冷杉醇的色譜峰位于15～16min，峰型不規(guī)則，非單峰曲線，原因可能是冷杉醇較易分解所致。

2.2不同品種鮮煙葉表面分泌物檢測

利用GC-MS對普通烤煙品種G28（不具有特殊香氣特性）、香料煙Samsun.香料煙Basma和大白筋599等4個品種進行了鮮煙葉表面分泌物的檢測（圖2）。主要表面改香前體物定性分析顯示，4個品種在西柏烷二萜（主要是a-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇）的成分類型上沒有明顯差異，差異主要存在于賴百當二萜和糖酯。從賴百當二萜分析，大白筋599和香料煙Samsun含有賴百當二萜冷杉醇，而普通烤煙G28和香料煙Basma不含冷杉醇：糖酯分析顯示，大白筋599和G28只含有I-II型糖酯類型：香料煙Samsun和香料煙Basma除含有I-II型糖酯類型外，還含有III-V型糖酯類型（含有3一甲基戊?；?，并且香料煙Basma的III-V型糖酯含量遠高于香料煙Samsun。由于大白筋599在田間具有類似香料煙Samsun（普通烤煙沒有）的特殊香氣，根據(jù)以上不同品種表面分泌物種類和含量差異情況，賴百當二萜冷杉醇在大白筋599和香料煙Samsun中都含有，而在普通烤煙中沒有，這可能是大白筋599特殊香氣特性的主要致香物質(zhì)基礎。2.3大白筋599與普通烤煙雜種后代穩(wěn)定品系表面分泌物檢測及感官鑒定

為了進一步確定賴百當二萜冷杉醇是引起大白筋599特異香氣性狀的關鍵物質(zhì)，分別選擇了G28和大白筋599的高代回交導入系C01和C02（G28為輪回親本），以及其雜交后代品系C03，進行了鮮煙葉表面分泌物的GC-MS檢測和烤后煙葉感官鑒定。3個品系GC-MS檢測結(jié)果如圖3，感官評吸結(jié)果及冷杉醇含量見表1。

由GC-MS檢測結(jié)果可見，C01和C03兩個品系均含有冷杉醇，并且C01冷杉醇的含量比大白筋599高53%，C03品系冷杉醇含量與大白筋599基本相當：C02中不含冷杉醇，從感官鑒定結(jié)果看，C01和C03感官上都具有大白筋599特異香氣性狀，C01特異香氣性狀表現(xiàn)比大白筋599更明顯，C03特異香氣性狀表現(xiàn)與大白筋599基本相當，C02沒有特異香氣性狀?？梢?，特異香氣性狀的濃郁表現(xiàn)與冷杉醇的有無及其含量的高低明顯相關。此外，C01和C02是G28與大白筋599雜交后以G28為回交親本連續(xù)回交的高代回交導入系（BC3F5），兩個近等基因系在冷杉醇含量有無的差異，說明大白筋599中調(diào)控冷杉醇合成的關鍵基因區(qū)段被成功導入C01中，但沒有成功導入C02中。此外，以大白筋599和普通烤煙為親本雜交培育的多個特香型新品系烤后煙葉致香成分檢測結(jié)果也表明，具有特異高香氣性狀的烤煙新品系，均含有冷杉醇。以上結(jié)果進一步證明冷杉醇是導致大白筋599具有特異香氣性狀的關鍵致香物質(zhì)。

2.4大白筋599特異香氣性狀形成的分子基礎

2012年，SALLAUD等揭示了賴百當二萜冷杉醇合成的分子機制，其主要受NtCPS2（II類萜烯合酶基因）和NtABS（類貝殼杉烯合酶基因）兩個腺毛特異表達基因調(diào)控合成。根據(jù)國外對150多個煙草種質(zhì)材料的研究結(jié)果，不含冷杉醇的品種，主要是NtCPS2基因發(fā)生序列變異所致。這些煙草品種中，NtCPS2基因在開放閱讀框的第275位堿基處存在8堿基插入序列（Indel）或在第292位堿基存在SNP突變（由G轉(zhuǎn)變?yōu)門），這兩種變異均在第4個外顯子上且在同一品種中不共存，并且90%以上的不含冷杉醇的品種中，NtCPS2基因發(fā)生了SNP突變。

為了進一步明確調(diào)控冷杉醇合成的關鍵基因NtCPS2在大白筋599和普通烤煙（無特異香氣性狀）間是否有差異，對具有特異香氣性狀的大白筋599、沒有特異香氣性狀的普通烤煙G28、紅花大金元（簡稱紅大）、K326、中煙100等煙草品種的NtCPS2基因的第4個外顯子進行了測序，結(jié)果表明（圖4，第4外顯子部分序列），大白筋599的NtCPS2基因第4個外顯子是正常序列，而G28、紅大、K326、中煙100等品種中NtCPS2基因均在292位堿基處發(fā)生了SNP突變。進一步檢測紅大、K326、中煙100等烤煙品種的鮮煙葉表面分泌物，結(jié)果顯示3個品種也不含冷杉醇（色譜圖略）?？梢?，大白筋599與普通烤煙品種中NtCPS2基因292位堿基的多態(tài)性，使該基因在不同品種中表達的蛋白活性不同，直接影響冷杉醇能否合成。

3討論

本研究通過對特異香型烤煙大白筋599、普通烤煙、香料煙以及大白筋599與普通烤煙（G28）雜交后代穩(wěn)定品系的表面分泌物檢測及烤后煙葉感官鑒定分析，明確了大白筋599特異香氣性狀形成的主要物質(zhì)基礎是賴百當二萜冷杉醇。研究結(jié)果很好的印證了以往對大白筋599的認識，如：大白筋599香氣特性類似香料煙Samsun而不是Basma，原因可能是Samsun中含有冷杉醇而Basma中不含：大白筋599田間生育期就能散發(fā)出特異香味，原因可能是冷杉醇在煙草腺毛中特異合成后，從腺毛中分泌到煙葉表面，并降解生成揮發(fā)性致香成分所致（冷杉醇在常溫下即可降解，而西柏烷二萜和糖酯等腺毛分泌物在常溫下不易降解）：此外，嫁接實驗表明，大白筋599特異香氣性狀的有無與接穗品種有關，而與砧木品種無關，原因可能是由于冷杉醇是在煙株地上部分的腺毛中特異合成所致。從遺傳角度分析，前期研究認為，大白筋599特異香氣質(zhì)的遺傳受單顯性基因控制，這與之前國外遺傳研究認為冷杉醇合成受單顯性基因控制的結(jié)果一致。直到2012年，SALLAUD等研究揭示了冷杉醇合成受兩個基因調(diào)控，并且缺一不可。造成冷杉醇遺傳研究結(jié)果和實際調(diào)控基因不一致的原因，之前研究結(jié)果認為是：冷杉醇的合成雖受兩個基因調(diào)控，但NtABS基因在各品種中均存在，并具有正常功能，僅是NtCPS2基因的序列多態(tài)性導致了品種間冷杉醇含量有無的差異，所以從遺傳角度看，就出現(xiàn)了冷杉醇（或大白筋599特異香氣質(zhì)）僅受1對單基因控制的表現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明，大白筋599中NtCPS2基因第292位堿基是野生型G而不是突變型T，是其能合成冷杉醇的關鍵分子基礎。同時大白筋599和主栽品種NtCPS2基因的測序結(jié)果對比也表明，NtCPS2基因的SNP突變，可能是導致大部分主栽煙草品種不含冷杉醇的重要原因。SALLAUD等對150多份煙草品種的研究結(jié)果表明，NtCPS2基因在煙草品種中雖有兩種突變形式（8堿基1NDEL和SNP），但兩種突變在同一品種中不共存，并且90%以上品種屬于SNP突變類型。本研究涉及的煙草品種中，NtCPS2基因均是SNP突變，與SALLAUD等的研究結(jié)果一致。目前已針對NtCPS2基因（調(diào)控冷杉醇合成的關鍵基因）開發(fā)了SNP分子標記，利用開發(fā)的分子標記對40多份烤煙種質(zhì)資源和近100份中煙100的EMS突變體新品系進行了篩選，從中篩選出烤煙品種革新三號和一個突變體品系含有冷杉醇標記，經(jīng)表面分泌物表型驗證，兩個材料確實含有冷杉醇。并且經(jīng)測序驗證，兩個種質(zhì)中NtCPS2基因的第292位堿基均是野生型G。根據(jù)相關文獻記載，革新三號也是田間具有特異香味的特香型品種。篩選出的含有冷杉醇的中煙100突變體新品系，具有沙姆遜（samsun）特征香韻，待后續(xù)開發(fā)利用。

國外大量研究表明，冷杉醇是煙草表面分泌物重要致香前體物，其降解產(chǎn)物主要是降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯等具有強烈龍涎香香氣的物質(zhì)，常用于煙草浸膏中，對增加卷煙香氣和吸味非常有效。通常情況下，普通烤煙一般不含冷杉醇，其主要存在于香料煙和雪茄煙中，由于不同煙草類型間主要植物學、農(nóng)藝性狀等差異較大，導致香料煙和雪茄煙向烤煙中轉(zhuǎn)移這種特異香氣性狀時，易帶進不利連鎖，且耗時耗力。本研究明確冷杉醇是大白筋599關鍵致香物質(zhì)基礎，并且明確NtCPS2基因第292位堿基的單核苷酸突變是導致生產(chǎn)主栽烤煙品種不含冷杉醇的主要原因。這些研究結(jié)果，將為今后通過分子育種手段快速培育含有冷杉醇的特色香氣烤煙品種提供較好的基礎。

煙草表面分泌物的主要成分是萜類和糖酯等致香前體物，其中賴百當二萜和糖酯在不同煙草品種類型間存在較大的差異，這些差異成分的降解產(chǎn)物對煙草香氣品質(zhì)具有重要貢獻，是不同類型煙草香氣風格特色形成的重要物質(zhì)基礎。通過遺傳改良，豐富煙草表面分泌致香前體物種類或含量，可以改變煙葉的香氣風格特色，改善煙葉香氣品質(zhì)，是培育特色香氣烤煙新品種的有效途徑。

4結(jié)論

研究表明，賴百當二萜冷杉醇是大白筋599特異香氣性狀的關鍵致香物質(zhì)基礎：調(diào)控冷杉醇合成的關鍵基因NtCPS2的序列差異（SNP）是大白筋599含有冷杉醇而生產(chǎn)主栽品種不含冷杉醇，進而導致其香氣風格特色不同的分子基礎。