尹鵬嘉 任民 陳愛國 孫鑫 周世奇 張玉 羅成剛 楊愛國 徐宗昌 文柳瓔

摘 要：解析煙堿轉運相關基因對煙堿積累的影響，可為定向改良煙堿性狀提供理論指導。本研究對7份煙堿含量不同的烤煙進行水培，檢測打頂前后煙堿含量、煙堿合成基因（NtPMT、NtQPT）、煙堿轉運基因（NtNUP1、NtJAT1/2、NtMATE1/2）以及囊泡運輸調節(jié)基因（NtGEF）的表達量變化。經相關分析、主成分分析和相關網絡分析表明：（1）煙堿合成基因NtPMT、NtQPT與煙堿轉運基因NtNUP1、NtMATE1/2相互促進表達；（2）根部和葉部的主效煙堿轉運基因中，NtJAT1是腰葉的主要煙堿轉運基因，NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2在根部對煙堿轉運都有貢獻，且轉運效率依次遞減；（3）囊泡運輸調節(jié)因子NtGEF也能間接影響葉部煙堿積累。因此，在對煙堿性狀進行定向改良時，可考慮煙堿合成、轉運以及囊泡運輸調節(jié)因子對煙堿積累的貢獻大小。

關鍵詞：烤煙；轉運基因；煙堿積累；相關性

中圖分類號：S572.03 文章編號：1007-5119（2018）05-0025-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.004

Abstract： In order to provide theoretical guidance for high quality tobacco breeding， analysis of contribution from nicotine transport related factors to nicotine accumulation was conducted. Seven flue-cured tobacco germplasms with different nicotine contents were planted in hydroponics devices and were treated by topping. The nicotine content， and expression levels of 2 key nicotine biosynthetic genes （NtPMT， NtQPT） and 3 transporters genes （NtNUP1， NtMATE1/2， NtJAT1/2） and a vesicular traffic regulator gene （NtGEF） were detected and analyzed. Correlation analysis， principal component analysis and related network analysis were conducted. The results showed that： （1） expression of nicotinic biosynthetic genes （NtPMT and NtQPT） and nicotine transporter genes （NtNUP1 and NtMATE1/2） was promoted by each other； （2） nicotine transporter genes that play dominant roles in leaves and roots were different. NtJAT1 was the dominant transporter in middle leaves； NtNUP1， NtJAT1 and NtMATE1/2 genes were the main genes of nicotine transportation in the root， with their transporting efficiency decreased in the above listed order； （3） the vesicular traffic regulator gene （NtGEF） also indirectly affected the accumulation of nicotine in middle leaves. Therefore， when seeking directional improvement for nicotine content， breeders should consider the influence of nicotine synthesis genes， transporter genes and vesicle transport regulatory factors on nicotine accumulation.

Keywords： flue-cured tobacco； transport efficiency； nicotine accumulation； expression analysis

煙堿是煙草的重要品質性狀之一，解析煙堿合成轉運基因對煙堿轉運積累的影響，可為煙草品質定向改良提供理論指導。煙堿在煙草根部合成，通過木質部運輸到地上部分，多數儲存在葉肉細胞的液泡中[1-2]。煙堿的合成積累受到多種因素影響，其中遺傳是主要因素。目前，已報道5種轉運蛋白具有轉運煙堿的功能。研究表明，煙堿轉運蛋白NtNUP1定位于質膜上，在根尖中較強表達，對煙堿轉運有很高的特異性；NtNUP1主要負責將胞質外體的煙堿轉運至胞質內，從而維持根部煙堿平衡[3-4]。其余4個轉運蛋白屬于多藥與毒素外排家族（Multidrug and Toxic Compound Extrusion，MATE），除轉運煙堿外還轉運其他底物。SHOJI等[5]研究發(fā)現(xiàn)，位于煙草根部液泡膜上的煙堿轉運蛋白NtMATE1/2調控根部液泡內煙堿的平衡。MORITA等[6]發(fā)現(xiàn)位于液泡膜上的煙堿轉運蛋白NtJAT1在根、莖、葉中都有表達，特別在綠葉中表達顯著，NtJAT1主要負責煙堿與質子轉運。另一種MATE家族的煙堿轉運蛋白NtJAT2在葉片中特異性表達，定位于葉部液泡膜上[7]。煙堿在根部合成的過程主要受NtPMT、NtQPT兩個關鍵基因調控[8-11]。此外，多數蛋白質通過囊泡運輸實現(xiàn)在細胞內的分選和定位，而鳥苷酸交換因子GEF具有激活Rab5蛋白的功能，可以調節(jié)蛋白質從高爾基到液泡的運輸[12]，因此推測NtGEF基因可能參與轉運蛋白的亞細胞定位，進而影響煙堿的轉運積累。

雖然已知煙草中NtGEF、NtNUP1、NtMATE1/2、NtJAT1/2等多個因子直接或者間接地參與了煙堿的轉運，但是這些基因對煙堿積累的貢獻大小以及其煙堿轉運效率的關系如何還未見報道。本研究采用分子生物技術及多種統(tǒng)計分析方法對7個烤煙品種的煙堿含量與煙堿轉運、合成相關基因進行檢測并分析，旨在為定向培育高煙堿品質煙草的育種工作提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

7份不同煙堿含量的烤煙品系種質資源（長葛

柳葉，09-53，NCTG-61，9201，大柳條，OX2028，K326）由國家煙草種質資源中期庫提供。其中高煙堿烤煙品種3份，低煙堿烤煙品種3份，對照采用全國主栽培品種K326。

1.2 試驗時間、地點

本試驗于2016—2017年在中國農業(yè)科學院煙草研究所進行，試驗材料苗期在人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng)[平均氣溫（25±2） ℃，相對濕度（60±5）%，光照12 h、黑暗12 h]，移栽期至成熟期在溫室培養(yǎng)[平均氣溫（28±2） ℃，相對濕度（50±5）%，光照12 h、黑暗12 h]。

1.3 試驗方法

1.3.1 水培裝置與營養(yǎng)液的制備 試驗材料苗期與成熟期的培養(yǎng)均采用水培，水培營養(yǎng)液采用Hoagland 全營養(yǎng)液，培養(yǎng)方式采用泡沫板漂浮培養(yǎng)，水培設備及布局參照專利標準[13]。

1.3.2 樣品采集及煙堿含量的測定 分別在打頂前和打頂后20 d，選擇生長狀態(tài)一致的煙株，并對煙株的腰葉、根部進行取樣，每3株混合為一個樣本，取3次生物學重復，用錫箔紙包裹后放入液氮，分別用于RNA提取和冷凍干燥。同時把采收的鮮煙葉用105 ℃殺青30 min并烘干[14]，制成煙葉樣品。殺青后煙葉樣品煙堿含量測定在農業(yè)部煙草產業(yè)產品質量監(jiān)督檢驗測試中心進行，檢測方法參照行業(yè)標準YC/T 217—2007，計算打頂后煙堿含量的增加量（Y）。

1.3.3 RNA的提取及qRT-PCR檢測 用RNAiso Plus（Takara，Code No.：9108）提取煙葉和煙根的總RNA，并用凝膠電泳和超微量分光光度計檢測 RNA 的濃度和質量，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，Code No.：RR047）將總 RNA 反轉錄成cDNA，稀釋5倍后利用 SYBR? Premix Ex Taq TM（Takara，Code No.：RR820）在熒光定量 PCR儀ABI 7500上進行qRT-PCR分析，其擴增程序參考文章標準[15]，每個樣品做3次技術重復。實驗中各個基因的特異引物見表2，其中NtMATE1/2、NtJAT2、NtGEF基因引物用Primer-BLAST（http：//www. ncbi.nlm. nih.gov/ tools/primer-blast/）設計，NtPMT、NtQPT、NtJAT1、NtNUP1基因引物參考文獻[4，6，16]。內參基因NtActin引物參照ZHANG等[16]文章。

1.4 數據分析

采用Excel 2013進行主成分分析數據標準化[17]處理，計算平均值、標準差及變異系數，實時熒光定量PCR數據計算采用2-△△CT方法計算[18]，用Graph Prism軟件中的Tukey法進行單因素方差分析，采用SAS 9.2[19-21]數據處理系統(tǒng)進行相關分析、主成分分析等統(tǒng)計分析，用UCINET6.0軟件[22]作煙堿與基因及基因之間的相關網絡圖。

2 結 果

2.1 打頂前后腰葉煙堿含量差異分析

由表2可以看出，在打頂后，腰葉煙堿含量均有不同程度的升高，說明打頂這一農藝措施對煙草煙堿的產生與積累具有積極的誘導作用。打頂后供試品種腰葉煙堿含量變異系數達54.55%，高于打頂前的煙堿含量變異系數47.05%，而打頂后的煙堿含量增加量的變異系數更是達到了80.96%，說明打頂后烤煙品種的煙堿含量開始急劇增加，不同煙堿種質烤煙的煙堿含量也是在打頂后才開始出現(xiàn)明顯的變化。在打頂后，大柳條的煙堿含量增幅最大，OX2028、09-53次之，說明烤煙煙堿含量受品種因素的影響較大。以上結果說明，打頂前后各個烤煙品種之間煙堿含量變異豐富，反映出不同品種的真實變化，可代表田間烤煙品種用于煙堿增量與煙堿基因表達的相關性分析。

2.2 打頂前后腰葉及根部煙堿基因表達量分析

分別對腰葉與根部2個組織的煙堿合成、轉運相關基因表達量檢測，并計算打頂后相對于打頂前的相對表達量，用單因素方差分析法對差異顯著的基因進行標識（表3）。結果表明，在成熟期葉部，打頂后的各個與煙堿代謝相關的基因相對打頂前表達量大部分上調，可以根據葉部5個基因的表達情況，把5個基因分成2類，第1類基因（NtGEF、NtJAT2、NtNUP1）在各供試品種中表達量均上調顯著；第2類基因（NtQPT、NtJAT1）在各試驗材料中既有上調也有下調表達，但多為上調表達。在成熟期根部，打頂后的各個與煙堿代謝相關的基因相對打頂前表達量既有上調也有下調，可以根據葉部7個基因的表達情況，把7個基因分成2類，第1類基因（NtJAT2、NtPMT、NtNUP1、NtGEF）在除NCTG-61外的供試品種中均為上調表達，第2類基因（NtJAT1、NtMATE1/2、NtQPT）供試品種中既有上調表達也有下調表達。

2.3 腰葉煙堿增量與葉部煙堿相關基因相關分析

對供試烤煙品種腰葉煙堿增量及5個煙堿轉運、合成基因的簡單相關分析（表4）表明，煙堿增加量（Y）只與NtJAT1呈顯著正相關。意味著腰葉中，煙堿轉運蛋白基因中可能只有NtJAT1的表達起主要作用，且NtJAT1轉運煙堿的貢獻多于NtJAT2。此外，NtGEF與NtQPT呈極顯著正相關，說明在腰葉中，囊泡運輸調節(jié)因子NtGEF與煙堿合成基因NtQPT的表達相互促進。由此可見，葉部煙堿相關基因之間也存在顯著的相關關系，所以僅根據簡單相關分析不能完全揭示其內部真實性關系。

2.4 腰葉煙堿增量與葉部煙堿相關基因的主成分分析

為對腰葉煙堿增量與基因表達量原始數據進行降維及防范基因之間多重共線性，采用主成分分析法對煙堿含量及煙堿合成、轉運基因進行分析（表5）。結果表明，影響煙堿增量的前2個主成分共同解釋了所有綜合信息的79.21%，且特征值均大于1，因此，可初步用于篩選影響煙堿增量的基因。

由表5可知，主成分1特征向量中載荷較高的主成分為NtQPT與NtGEF且符號與煙堿增量（Y）相同，說明腰葉中，NtQPT和NtGEF表達量變化越大煙堿增量也越大。NtQPT的原始變量對主成分1的影響程度為0.9684，大于NtGEF，表明NtQPT對煙堿增量的貢獻大于NtGEF。主成分2的特征向量中載荷較高的主成分為NtJAT1，說明腰葉中，煙堿轉運蛋白NtJAT1的基因表達量變化對煙堿增量影響也較大。此外，主成分1的貢獻率大于主成分2的，說明腰葉中NtGEF、NtQPT的表達變化對煙堿增量的影響大于NtJAT1。

2.5 腰葉煙堿增量與根部煙堿相關基因分析

對供試烤煙品種腰葉煙堿增量與根部7個煙堿轉運、合成基因進行簡單相關分析（表6），煙堿合成基因NtNUP1與煙堿增量（Y）呈顯著正相關（0.8493），說明NtNUP1對煙堿積累的直接影響顯著。另外，NtMATE1/2與NtQPT呈極顯著正相關，NtNUP1與NtPMT也呈顯著正相關，相關系數達0.8887，說明在烤煙根部的煙堿轉運基因（NtNUP1、NtMATE1/2）與煙堿合成基因（NtPMT、NtQPT）的表達相互促進。可見根部煙堿相關基因之間也存在顯著的相關關系，所以僅根據簡單相關分析不能完全揭示其內部真實性關系。

2.6 腰葉煙堿增量及根部煙堿相關基因的主成分分析

為了排除不同基因之間的相關關系對煙堿增量的間接影響，采用主成分分析方法對其進行分析（表7）。結果表明，影響腰葉煙堿含量變化的前3個主成分共同解釋了所有綜合信息的90.61%，且特征值均大于1。因此，可初步用于篩選影響煙堿增量的在根部表達的煙堿相關基因。

由表7可知，主成分1的特征向量中載荷量較高的主成分為NtPMT、NtNUP1，且符號與打頂前后腰葉煙堿增加量（Y）相同，說明在打頂后根部NtPMT、NtNUP1表達量上調倍數越高則腰葉煙堿增量也越大；主成分2的特征向量中載荷較高的主成分為NtJAT1、NtMATE1/2，且符號與打頂前后腰葉煙堿增量（Y）相同，說明打頂后根部NtJAT1、NtMATE1/2的表達量變化越大，則腰葉煙堿增量也越大；主成分3的特征向量中載荷較高的主成分為NtGEF（0.937 9），且符號與打頂前后腰葉煙堿增量（Y）相同，說明在根部NtGEF的表達量倍數變化越大，腰葉煙堿積累量也越大。此外，主成分1的貢獻率為46.21%>主成分2（30.68%）>主成分3（13.72%），說明主成分1至主成分3對原始變量的解釋力度依次減弱，意味著這些基因對腰葉煙堿增量的貢獻降低，從大到小依次為根部NtPMT、NtNUP1的表達量變化效應大于NtMATE1/2、NtJAT1的，繼而大于NtGEF的。而主成分1的原始變量中，NtPMT對主成分1的影響系數為0.975 7，大于NtNUP1（0.965 9），在主成分2的原始變量中，NtJAT1對主成分2的影響系數為0.924 2，大于NtMATE1/2（0.855 3）。說明根部煙堿合成基因NtPMT對腰葉煙堿增量的貢獻大于NtNUP1，煙堿轉運基因NtJAT1對腰葉煙堿增量的貢獻大于NtMATE1/2。

2.7 腰葉煙堿增量及煙堿相關基因的網絡關系

為了更加清晰準確地展現(xiàn)腰葉煙堿增量與煙堿轉運、合成基因的關系以及各個因子之間的關系，基于簡單相關系數，用UCINET 6.0分析軟件制作腰葉煙堿增量及煙堿轉運蛋白基因、煙堿合成基因之間的相關網絡圖（圖1A，B）。從分析結果來看，不同的節(jié)點有著不同的屬性，節(jié)點間有著豐富的關系屬性。在腰葉的相關網絡圖中，入度較高的節(jié)點即在整個腰葉煙堿積累中，有較高影響力的節(jié)點。圖中煙堿增量（indegree=4）、NtQPT（indegree=3），說明NtQPT在腰葉的煙堿積累過程中有較大貢獻。接近中心度最小的點為NtQPT（closeness=20）、NtGEF（closeness=20），說明2個基因在網絡中獨立性最強，其表達不易受到其他基因的影響。而出度最高的是NtGEF（outdegree=4），說明NtGEF是此網絡中與其他基因表達有交互作用最多的點。在與煙堿有交互的基因中，NtJAT1的交互強度最高，達到0.9，說明NtJAT1是腰葉中最主要的煙堿轉運基因，而NtJAT2對煙堿的轉運效率最低。

從圖1B中可以看出，在根部的煙堿合成及轉運的網絡中，入度較高的節(jié)點即在整個腰葉煙堿積累過程中有較高影響力的節(jié)點有煙堿增量（indegree=6）、NtMATE1/2（indegree=4）、NtNUP1（indegree=3），說明NtMATE1/2、NtNUP1在煙堿轉運積累過程中有較大作用。接近中心度最小的點為NtNUP1（closeness=26）、NtGEF（closeness=26），說明2個基因在網絡中獨立性最強，其表達不易受到其他點的影響。而出度最高的點是NtGEF（outdegree=6），說明NtGEF是此網絡中與其他基因表達有交互作用最多的點，NtGEF與NtMATE1/2、NtJAT1的交互強度為0.9，說明NtGEF對2個基因的表達影響最大。此外，與煙堿增量有交互作用的煙堿轉運基因中，NtNUP1交互強度最高達0.9，說明根部NtNUP1轉運煙堿的效率最高，NtJAT1，NtMATE1/2次之。

3 討 論

3.1 創(chuàng)傷影響煙堿相關基因表達

創(chuàng)傷可誘導煙堿轉運，合成基因上調表達[6]。為避免根部損傷導致煙堿相關基因表達變化，本研究采用新型水培循環(huán)系統(tǒng)，對高低煙堿烤煙品種進行種植。在該試驗條件下，7個烤煙品種打頂后的葉部煙堿含量相比于打頂前均增高，說明用溫室水培體系培養(yǎng)的煙草也表現(xiàn)出田間煙草植株積累煙堿的規(guī)律[23-26]，這為分析煙堿相關基因的表達提供穩(wěn)定的檢測環(huán)境。

3.2 在葉部表達且對煙堿積累有影響的基因

對煙草腰葉中煙堿積累與打頂前后相關基因表達差異分析顯示，腰葉中NtJAT1、NtQPT、NtGEF 3個基因是影響腰葉中煙堿增量的主要因子，NtJAT1是腰葉中最主要轉運煙堿的基因。張震彪等[27]報道腰葉在落黃過程中，轉運蛋白NtJAT1表達上調，本研究中NtJAT1基因在7個品種的腰葉中均為上 調表達，進一步說明在不同煙草品種中，NtJAT1基因對腰葉中煙堿積累均起到首要作用。

3.3 在根部表達且對煙堿積累有影響的基因

烤煙根部是煙堿合成和起始轉運的主要器官，共篩選出5個影響煙堿增量的主要因子，分別為NtPMT、NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2、NtGEF。煙堿合成基因NtPMT的表達對煙堿增量的貢獻大于3個煙堿轉運基因（NtNUP1，NtMATE1/2，NtJAT1）和囊泡運輸調節(jié)因子（NtGEF）。而KATO等[4]的研究表明NtNUP1是根部最主要的轉運基因。本研究中，在根部3個煙堿轉運基因中，NtNUP1對煙堿的增加貢獻最高，且表達量與腰葉煙堿增量呈極顯著正相關。這進一步證明不同煙草品種間，根部NtNUP1基因對煙堿積累均起到首要作用。

本研究中煙草中囊泡運輸調節(jié)因子（NtGEF）的基因表達對腰葉煙堿增量也有影響。已報道水稻OsGEF蛋白對去向液泡的蛋白運輸具有顯著的調控作用[28]，而本研究中根部NtGEF與幾個煙堿轉運基因有交互作用，并且NtGEF對NtMATE1/2、NtJAT1 2個基因的表達影響最大，推測NtGEF可能通過介導煙堿轉運蛋白（MATE1/2、NtJAT1）的定位來影響煙堿的積累。由此可推測，除已報道的煙堿合成、代謝途徑基因之外，還有其他未知因子參與煙堿積累。

3.4 遺傳對煙堿積累和相關基因的影響

品種遺傳背景是影響煙堿含量的主要因素[30-31]，不同煙堿含量的7個煙草品種，打頂前、后的煙堿含量在品種間增加差異較大。同時煙堿相關基因的表達量變化幅度在不同品種間表現(xiàn)不一致，這可能與各品種遺傳背景有很大關系。揭示影響煙堿積累遺傳因子還需要持續(xù)深入研究。

目前我國煙葉生產普遍存在上部葉煙堿含量偏高的問題，影響煙葉的利用。并且，隨著電子煙市場的逐漸開發(fā)，對高煙堿含量煙葉的需求不斷加大。本研究對煙堿合成及轉運基因對煙堿積累貢獻的差異進行分析，研究結果可為早期高煙堿品種的分子選育提供可用的基因資源，也為煙草葉片的煙堿積累調控提供理論指導。

4 結 論

不同煙堿相關基因對煙堿增量的貢獻程度不同。葉部NtJAT1、NtQPT、NtGEF 是影響煙堿積累3個主要基因，且NtJAT1是葉部影響煙堿轉運的主要基因。根部NtPMT、NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2、NtGEF 5個基因影響煙堿積累，其中煙堿合成基因NtPMT對煙堿增量影響最大，且NtNUP1是根部最主要的煙堿轉運基因。囊泡運輸調節(jié)因子NtGEF在葉部和根部對煙堿積累都有影響。

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