洪丹，樓哲豐，鄭九嘉，黃學(xué)鋒，金龍金

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實驗室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

全球有近15%的不孕不育夫婦，男性因素約占50%[1]，其中男性不育患者中有14%～15%伴有精子數(shù)量或質(zhì)量異常[2]。魚精蛋白作為成熟精子中主要的核蛋白，包括魚精蛋白1和魚精蛋白2家族，分別由PRM1和PRM2編碼[3]，其轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾均涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[4-5]，與精子形成、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、男性不育密切相關(guān)[6-7]。TBP相關(guān)因子2（TBP related factor 2，TRF2）是哺乳動物睪丸組織中特異性表達(dá)的調(diào)控因子，對精子形成過程中某些特異性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用[8]。本研究通過檢測PRM1、PRM2、TRF2的表達(dá)以及精子染色質(zhì)包裝質(zhì)量，探討成熟精子中轉(zhuǎn)錄因子TRF2、魚精蛋白和染色質(zhì)包裝質(zhì)量與少精子癥的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 28例少精子癥患者、16例畸形精子癥患者和15例正常對照者標(biāo)本來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖中心。所有標(biāo)本在采集前禁欲3～5 d，采集后在37 ℃、20～30 min完全液化，采用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）分析和改良巴氏染色法，按WHO（第五版）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。此外，入選的所有標(biāo)本經(jīng)鏡檢驗證無圓細(xì)胞及白細(xì)胞污染，同時均需符合：無生殖系統(tǒng)感染、無內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)疾病、無隱睪和精索靜脈曲張、抗精子抗體陰性。所有標(biāo)本來源經(jīng)本人知情同意并簽署知情同意書。收集的標(biāo)本分裝后用于后續(xù)各項實驗。

1.2 主要試劑 Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司，色霉素A3（chromomycin A3，CMA3）染料購自美國Sigma公司，DEPC水購自上海生工生物工程股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 精子純化：精液標(biāo)本離心后棄上清，PBS吹打混勻，離心，棄上清；重復(fù)2～3次。

1.3.2 精子RNA提?。褐貞壹兓玫木映恋?，加入Trizol，混勻后靜置；加入氯仿混勻后靜置再離心；吸取上層水相后加入等體積的異丙醇，混勻靜置后離心；棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，混勻后離心，棄上清，重復(fù)1次；沉淀干燥至半透明，用DEPC水溶解；檢測RNA濃度、純度及完整性。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：配置反應(yīng)體系，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s反應(yīng)，產(chǎn)物作為后續(xù)實驗的模板。

1.3.4 qPCR：通過Primer bank搜索或Primer Premier5.0軟件設(shè)計目的基因引物，使用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對后，交由華大基因公司合成。引物序列（5’→3’）如下：PRM1 F：CAGCCCACAGAGTTCCA CCT，R：GCACCTCATGGCTCTCCTC；PRM2 F：GCAAGAGC AAGGACACCAC，R：AGCCTCTGCGATGCCTCCT；TRF2 F：AACAACAAAGCAAGGAAGACGGAGT，R：AAGGAGAAGCTGGA GGACAAGGAT；GAPDH F：GCCAGTGGACTCCACGAC，R：CAACTACATGGTTTACATGTTC。配置反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、循環(huán)40次。

1.3.5 CMA3染色：配置CMA3染料，純化的精子沉淀調(diào)成40×106/mL的精子懸液混勻后均勻地涂在潔凈的載玻片上；干燥后固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）中固定10 min；PBS反復(fù)沖洗，干燥后加50 μL CMA3染料均勻覆蓋涂片，避光染色20 min；PBS反復(fù)沖洗，干燥后普通熒光顯微鏡觀察。以發(fā)出明亮黃色熒光的精子為陽性，暗淡熒光或是無熒光的為陰性。每例標(biāo)本至少計數(shù)200個精子，CMA3陽性率=陽性精子數(shù)/（陽性精子數(shù)+陰性精子數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本資料 少精子癥組平均年齡為（30.36±0.97）歲，畸形精子癥組為（32.50±1.28）歲，正常對照組為（30.00±1.07）歲。各組精液參數(shù)見表1。

表1 少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組精液參數(shù)（±s）

表1 少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組精液參數(shù)（±s）

2.2 qPCR結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCq法分別計算3組PRM1、PRM2和TRF2 mRNA相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，少精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的25%（P＜0.05）和20%（P＜0.05）；畸形精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的66%和69%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A-B。與正常對照組相比，少精子癥組和畸形精子癥組TRF2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的128%和119%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1C。

2.3 CMA3染色結(jié)果與陽性率計算 CMA3染色結(jié)果顯示少精子癥組CMA3陽性率為（20.47±1.19）%，畸形精子癥組為（14.31±2.01）%，正常對照組為（10.69±1.45）%；少精子癥組陽性率是正常對照組的191%（P＜0.001）；畸形精子癥組陽性率是正常對照組的134%（P＞0.05）。見圖2。

圖1 3組PRM1、PRM2和TRF2 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

超過一半的男性不育患者病因尚不明確，先天或后天因素都能導(dǎo)致不育的發(fā)生。輔助生殖技術(shù)尤其是胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)，已能幫助部分由男性因素引起不育的夫婦獲得子代[9-10]。然而該技術(shù)可能逃避受精過程中對潛在具有遺傳缺陷的異常精子的自然選擇機(jī)制，沒有對潛在的遺傳缺陷進(jìn)行全面的篩查，因此有必要深入研究精子功能。

精子質(zhì)量低下是造成精子功能異常和男性不育的重要原因。研究表明，前來就診的男性不育患者中約有30%為不明原因的少精子癥或無精子癥[11]，由于本研究收集的精液標(biāo)本中少精子癥常伴隨畸形精子癥，因此本研究分別檢測少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組中魚精蛋白表達(dá)情況并初步探討其中可能的發(fā)生機(jī)制。

精子發(fā)生包括精原細(xì)胞的有絲分裂、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子形成。精子形成的特征性事件之一是核蛋白組型轉(zhuǎn)換，與核DNA結(jié)合的組蛋白被過渡蛋白取代，最終被睪丸特異性的魚精蛋白取代，這一過程能夠使細(xì)胞核濃縮形成精子特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而保證遺傳信息的傳遞[12]。研究表明，魚精蛋白2表達(dá)水平降低導(dǎo)致的雄性小鼠不育與PRM1和PRM2突變有關(guān)，二者任一等位基因突變都會導(dǎo)致單倍型的缺乏[13]。本研究針對魚精蛋白（PRM1和PRM2）轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，少精子癥組中PRM1和PRM2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的25%與20%，表達(dá)顯著降低；而畸形精子癥組則無統(tǒng)計學(xué)差異。提示PRM1和PRM2 mRNA表達(dá)量減少可能是成熟精子數(shù)量減少而非成熟精子形態(tài)異常的原因。

圖2 CMA3染色結(jié)果及陽性率比較（×400）

那么魚精蛋白表達(dá)異常是如何影響下游水平，又是如何受到上游調(diào)控，從而使得成熟精子數(shù)量減少？一方面，魚精蛋白對于精子核結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和核染色質(zhì)的濃集具有重要作用[14]。本研究通過CMA3染色檢測精子染色質(zhì)包裝質(zhì)量，評估精子內(nèi)魚精蛋白的表達(dá)水平[15]，發(fā)現(xiàn)少精子癥組中CMA3陽性率顯著高于正常對照組，畸形精子癥組與正常對照組之間則無統(tǒng)計學(xué)差異，說明染色質(zhì)包裝異?？赡苁浅墒炀訑?shù)量減少而非成熟精子形態(tài)異常的原因。魚精蛋白是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)成分之一，其表達(dá)減少使得核蛋白與DNA親和力降低，從而影響DNA-魚精蛋白復(fù)合體的形成；更有研究表明，PRM2敲除小鼠精子細(xì)胞染色質(zhì)濃縮不全、DNA損傷加劇，即使通過胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)都無法生育[16]。結(jié)合本研究結(jié)果提示，魚精蛋白表達(dá)減少可能是通過影響精子染色質(zhì)包裝結(jié)構(gòu)，使得精子形成過程異常，而這可能是成熟精子數(shù)量減少的原因。另一方面，精子形成中（除基本轉(zhuǎn)錄因子之外）許多睪丸特異性的轉(zhuǎn)錄因子和一些基本轉(zhuǎn)錄因子的特異轉(zhuǎn)錄本形式，或通過調(diào)節(jié)PRMs轉(zhuǎn)錄活性，或在轉(zhuǎn)錄后修飾等方面發(fā)揮重要作用[17-18]。睪丸特異性調(diào)控因子TRF2能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 IIA和TF IIB形成大分子蛋白復(fù)合體，抑制RNA聚合酶 II的轉(zhuǎn)錄[19]。我們的結(jié)果顯示，少精子癥組與正常對照組、畸形精子癥組與正常對照組的TRF2 mRNA表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。MARTIANOV等[20]對基因敲除小鼠的研究顯示，單倍體精子中TRF2 mRNA表達(dá)有2個高峰期：圓形精子細(xì)胞和延長形精子細(xì)胞。本研究檢測到成熟精子中TRF2 mRNA表達(dá)量明顯低于PRM1和PRM2 mRNA的含量，提示在成熟精子中對TRF2的檢測可能沒有實際意義。

綜上所述，魚精蛋白（PRM1和PRM2）mRNA表達(dá)量減少，可能影響精子染色質(zhì)包裝，使得精子形成過程異常，這可能是成熟精子數(shù)量減少的原因。成熟精子中TRF2 mRNA表達(dá)量較低，可能與其僅在精子形成過程早期表達(dá)有關(guān)，可通過檢測生精細(xì)胞中TRF2以及其他階段特異性表達(dá)基因[21]表達(dá)，研究其與少精子癥、魚精蛋白的相關(guān)性，從而進(jìn)一步探討調(diào)控魚精蛋白表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。

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