劉淑集，陳梧英，許 旻，李 輝，蘇永昌，張伯超，喬 琨，蘇 捷，劉智禹

(1福建省水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門)，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013；2閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000)

河鲀(Tetraodontidae)，俗稱“河豚魚”，屬于脊索動物門、鲀形目、鲀科，是一種高蛋白、低脂肪的魚類，具有很高的食用價值，野生河鲀有劇毒。雄性河鲀性成熟期的精巢(俗稱魚白)占整個雄魚體質(zhì)量的7 %[1]以上。除蟲紋東方鲀(Takifuguvermicularis)精巢含有河豚毒素外，其他品種的精巢基本不含[2-3]。2016年，農(nóng)業(yè)部等聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營的通知》[4]；福建省也發(fā)布了關(guān)于加快推進養(yǎng)殖河鲀產(chǎn)業(yè)發(fā)展的實施意見，推進菊黃東方鲀(TakifuguFlavidus)和雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)的人工養(yǎng)殖。據(jù)統(tǒng)計，福建省河鲀養(yǎng)殖面積約10萬畝(6 666.67 hm2)，產(chǎn)量9 200 t，占全國河鲀養(yǎng)殖總產(chǎn)量30%左右[5]。

魚類精巢中含有豐富的營養(yǎng)成分，其中魚精蛋白是利用價值較高的蛋白質(zhì)。魚精蛋白是一種富含精氨酸的天然多聚陽離子堿性蛋白質(zhì)，通常與魚精脫氧核糖核苷酸以1∶2的比例結(jié)合，形成精核蛋白存在于魚類精巢組織中[6]。魚精蛋白成分天然，安全性較高[7]，具有良好的廣譜抗菌特性[8-10]。此外，魚精蛋白具有較高的營養(yǎng)和藥理功能特性[11-12]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前魚精蛋白主要是從鱒魚、鯡魚、鮭魚、鯉魚、魷魚等[13-14]提取。常用的魚精蛋白提取方法主要是利用NaCl溶液溶解硫酸或鹽酸提取，再利用冷乙醇沉淀獲得[15-18]，而從河鲀提取魚精蛋白的報道還未見。本研究以菊黃東方鲀精巢為原料，進行河鲀魚精蛋白提取工藝研究，獲得提取魚精蛋白最佳工藝條件，為提取河鲀魚精蛋白的相關(guān)研究提供工藝參考，也為河鲀加工產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：菊黃東方鲀凍干精巢，購自福建省鲀之鮮水產(chǎn)有限公司，真空冷凍干燥；濃硫酸(分析純)、NaCl(分析純)、磷酸(分析純)、考馬斯亮藍G-250(分析純)，均產(chǎn)自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純)，產(chǎn)自上海泰坦科技股份有限公司；河豚毒素ELISA檢測試劑盒，購自江蘇美正生物科技有限公司。

試驗儀器：pH計(PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；高速冷凍離心機(centrifuge 5810R，德國 Eppendorf)；電子分析天平(BS 124S，德國Sartorius)；超低溫冰箱(Forma -86 ℃，美國Thermo)；酶標儀(M200 PRO，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)；渦旋混合儀(XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D，鞏義市予華儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6，常州國華電器有限公司)；數(shù)顯磁力攪拌器(C-MAG HS7，艾卡中國儀器設(shè)備有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(寧波新藝生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 河鲀精巢成分及安全性測定

水分參照GB/T 5009.236—2016 中的直接干燥法測定[19]；粗蛋白質(zhì)參照GB 5009.5—2016 中的凱氏定氮法測定[20]；粗脂肪參照GB/T 5009.6—2016 中的索氏抽提法測定[21]；灰分測定參照GB/T 5009.4—2016 中的灼燒稱重法測定[22]。河豚毒素( TTX ) 按照河豚毒素ELISA檢測試劑盒說明書進行檢測，評價標準[23]為：TTX ≥ 1 000 MU/g為劇毒，記為A級；100～999 MU/g為強毒，記為B級；10～99MU/g為弱毒，記為C級；<10 MU/g為無毒，記為D級，1MU=0.18 μg/g TTX。

1.2.2 魚精蛋白提取工藝

魚精蛋白提取工藝參照胡曉璐等[24]、饒丹華等[25]的方法并稍作修改。稱取10.00 g的河鲀精巢干制品，加入100 mL不同pH、濃度為 0.14 mol/L的NaCl溶液，攪碎勻漿2 min，置于25 ℃下，10 000 r/min離心20 min，棄上清液。在沉淀物中按照比例加入硫酸溶液，在設(shè)定的溫度條件下提取一定時間，6 000 r/min離心15 min，取上清液。加入不定量體積無水乙醇進行沉淀，靜置過夜，8 000 r/min離心15 min，取沉淀液置于培養(yǎng)皿內(nèi)，吹風(fēng)晾干，在-20 ℃冰箱中凍藏一夜，真空冷凍干燥，所得干制品即為魚精蛋白粗提物。此試驗設(shè)置重復(fù)試驗3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 試驗指標的測定

魚精蛋白提取率計算：真空冷凍干燥后取出樣品，稱取其重量，采用魚精蛋白提取率Y表示：

Y=100%×(E/M)

(1)

式中：Y—魚精蛋白提取率；E—凍干后魚精蛋白粗提物，g；M—凍干河豚精巢，g。

1.2.4 魚精蛋白提取條件單因素試驗

以魚精蛋白提取率為指標，在固定其他影響因素保持不變的狀態(tài)下，分別考察硫酸濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)、pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、硫酸用量(離心所得沉淀體積的1、2、3、4、5倍)、提取時間(1、2、3、4、5 h)、提取溫度(4 ℃、25 ℃、45 ℃、65 ℃、85 ℃)、乙醇用量(分別設(shè)定為離心所得上清液體積的1、2、3、4、5倍)對魚精蛋白提取效果的影響，每個水平試驗重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化魚精蛋白提取工藝條件

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取NaCl溶液pH(A)、硫酸用量(B)與提取時間(C)3個因素作為自變量，以魚精蛋白提取率(Y)作為響應(yīng)值，在pH(7、8、9)、硫酸用量(3、4、5倍)和提取時間(1.5、2、2.5 h)3因素3水平上對魚精蛋白提取條件進行響應(yīng)面優(yōu)化，并進行驗證。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 河鲀精巢成分測定結(jié)果

從菊黃東方鲀精巢成分的分析結(jié)果可以看出，凍干精巢的成分含量從高到低排列依次為蛋白質(zhì)(78.0%)、灰分(10.4%)、粗脂肪(5.8%)、水分(5.0%)、碳水化合物(0.8%)，蛋白質(zhì)占比最大，可見該河鲀精巢中含有豐富的蛋白質(zhì)，而魚精蛋白是其中的主要蛋白，且具有良好的功能特性。同時對菊黃東方鲀精巢的河豚毒素進行測定，測定結(jié)果低于限值，屬于D級(無毒)，說明精巢是安全無毒的，與Itoi等[26]的研究結(jié)果一致。

2.2 各單因素對河鲀魚精蛋白提取率的影響

2.2.1 NaCl溶液pH的影響

NaCl溶液的pH對魚精蛋白的提取影響顯著。魚精蛋白為偏堿性蛋白質(zhì)，保持中性至偏堿性，有利于魚精蛋白的提取[27-28]。圖1為各因素對魚精蛋白提取率的影響結(jié)果。由圖1a可知，隨著溶液堿性的提高，魚精蛋白提取率逐漸升高，當?shù)竭_pH10時，提取率顯著下降。因此，選取pH 8作為最佳提取點。

圖1 各單因素對魚精蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of every single factor on the extraction rate of protamine

2.2.2 硫酸濃度的影響

魚精蛋白的提取率在低濃度范圍內(nèi)受硫酸濃度的影響顯著。從圖1b可知，硫酸濃度在0.2～0.6 mol/L中變化時，魚精蛋白的含量明顯增加，濃度到達0.6 mol/L時，魚精蛋白的提取率達到最大值，之后隨著硫酸濃度的繼續(xù)增加，魚精蛋白的提取率反而呈下降趨勢，當濃度增至0.8～1.0 mol/L之間時，提取率呈穩(wěn)定趨勢，說明魚精蛋白的提取已接近飽和狀態(tài)，再高濃度的硫酸可能會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，降低提取率。因此，選取硫酸濃度為0.6 mol/L作為提取最佳濃度。

2.2.3 硫酸用量的影響

硫酸用量對魚精蛋白的提取影響顯著。如圖1c所示，魚精蛋白的提取率隨著硫酸用量的增加呈先升后降的趨勢，在1～2倍沉淀體積下魚精蛋白溶解度較小，在2～4倍沉淀體積時提取率明顯提高，隨著硫酸用量的增加，魚精蛋白與提取液的相互結(jié)合能力明顯增強，但用量繼續(xù)增加到5倍時，操作過程的繁瑣程度增加，且轉(zhuǎn)移溶液以及離心過程中的誤差增大，提取率反而降低。考慮到成本以及提取率含量值，選擇硫酸用量在4.0倍沉淀體積時為最佳。

2.2.4 提取溫度的影響

提取溫度對魚精蛋白的影響如圖1d所示。在較低溫度范圍內(nèi)，魚精蛋白提取率的變化趨勢較為平緩，而在較高溫度范圍內(nèi)提取率急劇降低。當溫度到達45 ℃時提取率達到峰值，效果顯著。適當提高溫度對于提高魚精蛋白提取率有積極作用。這可能是因為，適當提高溫度能增大分子之間的相互作用，提高分子運動的速度，從而增大蛋白質(zhì)分子的溶解性[25]，但溫度進一步升高會破壞蛋白質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)，所提取得到的魚精蛋白呈黃色甚至偏褐色狀態(tài)，且后續(xù)表現(xiàn)出的水溶性較差。因此，選取45 ℃作為最佳提取溫度較為合適。

2.2.5 提取時間的影響

由圖1e可知，提取時間在1～2 h內(nèi)，魚精蛋白的提取速度增長明顯，在2 h時達到最大值，隨著時間的延長，提取率逐漸降低。這可能是由于提取過程中，魚精蛋白與提取液的相互作用減弱，達到相對平衡后難以繼續(xù)升高，且隨著時間的延長，提取液與被提取物中的其他物質(zhì)發(fā)生結(jié)合，易導(dǎo)致雜質(zhì)增多。因此，以2 h為最佳提取時間。

2.2.6 乙醇用量的影響

乙醇用量對魚精蛋白提取率的影響如圖1f。隨著乙醇用量的增加，魚精蛋白提取率先明顯上升，后逐漸趨于平緩。魚精蛋白的提取率起先變幅較小，隨著使用倍數(shù)增加提取率迅速上升，當達到4.0倍沉淀體積用量時，魚精蛋白的溶解呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，而后逐漸平緩，說明魚精蛋白的提取接近穩(wěn)定。因此，選取4.0倍沉淀體積乙醇用量作為最佳沉淀劑用量。

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

對各單因素試驗數(shù)據(jù)進行組間顯著性分析發(fā)現(xiàn)，硫酸用量、提取時間、pH及乙醇用量4個因素在設(shè)定的水平之間均有顯著性差異(P=0.000、0.000、0.016、0.016)。由于乙醇是后續(xù)用來沉淀蛋白的，用量比較大，后續(xù)還要離心，操作繁瑣，因此選擇以NaCl溶液pH(A)、硫酸用量(B)、提取時間(C)作為自變量，以魚精蛋白提取率(Y)作為因變量，應(yīng)用Design-Expert軟件，進行3因素3水平的魚精蛋白提取條件優(yōu)化，試驗結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果Tab.1 Design scheme and result of response surface methodology

以魚精蛋白提取率(Y)關(guān)于NaCl溶液pH(A)、硫酸用量(B)、提取時間(C)所建立的二次回歸響應(yīng)面模型，如以下方程所示：

Y=-38.528+9.374A+5.162B+5.752C+0.034AB+1.424AC-0.603BC-0.759A2-0.491B2-3.168C2

2.3.1 方差分析

二次模型的方差分析結(jié)果(表2)顯示，模型P=0.042 5<0.05，說明魚精蛋白提取率的回歸方程模型顯著；失擬項P=0.143 8>0.05，失擬不顯著，回歸方程較為可靠，回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，可準確模擬各個因素對河鲀魚精蛋白提取率的影響，且預(yù)測值能較好地與實際操作計算出的魚精蛋白提取率相吻合。

表2 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.2 Variance analysis of the regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析

各因素對魚精蛋白提取率影響的交互作用響應(yīng)面及等高線圖如圖2所示。NaCl溶液的pH與提取時間對魚精蛋白提取率影響的交互作用效果如圖2a、2b所示，隨著提取時間的逐漸延長和NaCl溶液pH的增加，魚精蛋白的提取率先升高后下降，交互曲面整體呈現(xiàn)凸起，呈倒U型變化，且等高線圖呈橢圓形，說明NaCl溶液的pH與提取時間二者有一定交互作用。圖2c、2d中，隨著NaCl溶液pH的增大，魚精蛋白的提取率先升高后降低，隨著硫酸用量的加大，也呈現(xiàn)先升高后微降低并趨于穩(wěn)定的態(tài)勢，二者交互后整體曲面的變化趨勢相對圖2a的曲面比較平緩，但其等高線圖仍呈橢圓形，說明NaCl溶液pH和硫酸用量存在交互作用。而在圖2e、2f中，魚精蛋白提取率隨著提取時間的增加逐漸提高，隨著硫酸用量的加大也緩慢增加，從相互作用的等高線圖看，二者之間的交互作用不明顯。

通過Design-Expert8.0分析軟件，得到河鲀精巢魚精蛋白的最佳提取條件是：NaCl溶液pH 8.55，硫酸濃度0.6 mol/L，硫酸用量為離心所得4.05倍沉淀體積，提取率預(yù)測值19.02%。為了便于實際操作，將模型優(yōu)化出的最優(yōu)提取條件簡化為：NaCl溶液pH 8.5，硫酸用量為離心所得4.0倍沉淀體積，提取時間2.4 h，硫酸濃度0.6 mol/L，提取溫度45 ℃，乙醇用量為上清液的4.0倍沉淀體積。在此條件下進行3次重復(fù)試驗，計算得到魚精蛋白的提取率為19.07%，與預(yù)測值相比沒有顯著性差異，說明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

3 結(jié)論

檢測了菊黃東方鲀精巢的河豚毒素含量，證實其屬于無毒級別。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面應(yīng)用于優(yōu)化河鲀精巢魚精蛋白的提取，結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化河鲀精巢魚精蛋白提取方法合理可行，得到最佳的提取工藝條件為：NaCl溶液pH 8.5，硫酸用量4.0倍沉淀體積，提取時間2.4 h，硫酸濃度0.6 mol/L，提取溫度45 ℃，乙醇用量為4.0倍沉淀體積，魚精蛋白實際提取率為19.07%。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線 Fig.2 Response surface diagrams and contour of interaction between every factor

從河鲀精巢提取魚精蛋白，對于研究魚精蛋白的理化特性以及相關(guān)功能特性提供了試驗基礎(chǔ)，能夠起到有效利用河鲀精巢組織的作用。未來關(guān)于魚精蛋白的研究需要進一步深入，繼續(xù)改進、創(chuàng)新以提高魚精蛋白的提取率，增加魚精蛋白提取純度，最終能適應(yīng)實際生產(chǎn)需要。

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