丁婷婷，吳杭菲，劉成，湯雯，王圣凱，鄭靖宇，朱再勝，彭天慶

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.病理科；2.老年病科）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外乙醇和其他明確的損肝因素所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1]。研究表明氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一[2-3]。沉默調(diào)節(jié)蛋白1（silent information regulater 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的蛋白去乙?；?。REN等[4]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過減少脂肪酸及甘油三酯（triglycer-ide，TG）產(chǎn)生、調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)及抵抗氧化應(yīng)激而在NAFLD中發(fā)揮重要作用。L6H4是去除了姜黃素β-二酮基團(tuán)的姜黃素衍生物，具有更好的穩(wěn)定性，已被證實(shí)具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化等廣泛的藥理作用。目前，已有研究表明姜黃素能夠明顯阻礙NAFLD的進(jìn)展，但關(guān)于姜黃素衍生物L(fēng)6H4防治NAFLD的研究卻少有報(bào)道。本研究通過高脂誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型，用姜黃素衍生物L(fēng)6H4進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠血脂、肝臟氧化應(yīng)激水平和形態(tài)學(xué)改變，并檢測(cè)SIRT1、發(fā)動(dòng)相關(guān)蛋白1（mitochondrial dynamin-related protein1，DRP 1）和線粒體融合蛋白2（mito fusion 2，MFN2）在大鼠肝臟組織中的表達(dá)，探討姜黃素衍生物L(fēng)6H4對(duì)NAFLD發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制，為NAFLD的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型建立與處理 選用12周齡、體質(zhì)量為（280±20）g的雄性SD大鼠（由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可號(hào)：WYDW2014-0052）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，正常組（control組）、模型組（NAFLD組）和治療組（L6H4組），每組8只。control組給予基礎(chǔ)飼料，余2組全程給予高脂飼料（上海普路騰生物科技有限公司），配方及營養(yǎng)素占比見表1-2。L6H4組并從第9周開始用姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)治療。具體方法：于每天下午1∶00-2∶00按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予L6H4組0.2 mg?kg-1姜黃素衍生物L(fēng)6H4溶于1%的羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）灌胃，control組和NAFLD組給予相應(yīng)體積的1% CMC灌胃。至20周末禁食12 h后，用腹腔注射水合氯醛處死各組大鼠。分別收集全血及取部分肝組織置4%中性甲醛溶液中固定，用于肝組織形態(tài)學(xué)觀測(cè)；另取部分肝組織置-80 ℃冰箱迅速冷凍備用。

表1 高脂飼料配方（g/100 g）

表2 各營養(yǎng)素占比（%）

1.2 藥品與主要試劑 姜黃素衍生物L(fēng)6H4（溫州醫(yī)科大學(xué)梁廣教授惠贈(zèng)）；蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物公司）；蛋白一抗（美國CST公司）；蛋白二抗（美國Bioword公司）；ECL發(fā)光液（杭州弗德生物科技公司）；Trizol、PCR引物合成（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連Takara公司）；RT-PCR試劑盒（美國ABI公司）；超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 血脂的檢測(cè)：大鼠麻醉后斷頭取全血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠的TG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。

1.3.2 光鏡標(biāo)本制作：取4%中性甲醛溶液固定24 h肝組織，按常規(guī)行乙醇梯度脫水、石蠟包埋后，切片（厚度為5 μm），分別用于常規(guī)HE染色和Masson染色[5]，光鏡下觀察肝組織的病理變化情況。

1.3.3 肝組織中MDA含量及T-SOD活力檢測(cè)：分別稱取各組大鼠肝組織，每只15 mg，分別放入已加裂解液的Ep管中，冰上勻漿，置4 ℃離心（13000 r/min，15 min），取上清液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)各組肝臟組織內(nèi)MDA含量及T-SOD活力，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，并重復(fù)3次。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)：分別稱取各組大鼠肝組織，每只20 mg，分別放入已加1 mL Trizol的預(yù)冷去酶Ep管中，按Trizon試劑說明書方法提取總RNA。以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取適量cDNA以10 μL體系放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參照，根據(jù)循環(huán)（Ct）值用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。SIRT1引物序列上游：5’-CGGACAGTTCCAGCC ATCTC-3’，下游引物：5’-CAAAGGAACCATGACACTGAATG-3’；DRP1引物序列上游：5’-GAAGTGGTGCAGTGGAAATG AC-3’，下游引物：5’-GTTTCTATTGGGAACCACTGCC-3’；MFN2引物序列上游：5’-CACTACCACATCGGACACCCTA-3’，下游引物：5’-GAACTTGTGTCTTGCATTTGGC-3’；β-actin引物序列上游：5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Western blot檢測(cè)：如1.3.3處理肝組織，測(cè)定蛋白濃度，定容定量后取樣品加熱變性，加樣，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，TRS-T洗膜后4 ℃下一抗搖床過夜，洗膜后 II抗室溫孵育1 h，再次洗膜后加化學(xué)發(fā)光液，用Image-lab成像儀曝光顯影。用計(jì)算機(jī)分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參條帶積累吸光度（A）比作為反映目的蛋白表達(dá)的相對(duì)指標(biāo)。一抗?jié)舛龋焊鞯鞍字笜?biāo)1∶1000；內(nèi)參1∶5000； II抗?jié)舛?∶5000，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD法。方差不齊者則用Tamhane’s T2法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂的比較 與control組比，NAFLD組大鼠血清中TG、TC和LDL-C濃度均顯著升高，而HDL-C濃度顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NAFLD組比，L6H4組大鼠血清中TG、TC和LDL-C的濃度較均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血脂水平比較（n=8，±s，mmol/L）

表3 各組大鼠血脂水平比較（n=8，±s，mmol/L）

與control組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與NAFLD組比：cP＜0.05，dP＜0.01

2.2 肝臟形態(tài)學(xué)變化 肝組織HE染色顯示：control組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈多面體形，胞漿豐富，胞核居中，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞呈單行條索狀向周圍呈放射狀排列，肝索間可見明顯的肝竇；NAFLD組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，大量肝細(xì)胞脂肪變性，顯示細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡，胞核偏離或靠近胞膜，肝竇消失，肝小葉內(nèi)可見局灶性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤；L6H4組肝小葉結(jié)構(gòu)較紊亂，部分肝細(xì)胞脂肪變性，胞漿內(nèi)可見小空泡，大部分胞核居中，小葉內(nèi)未見明顯的壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，可見L6H4組脂肪變性較NAFLD組明顯減輕。見圖1A-C。肝組織Masson染色顯示：control組大鼠肝組織匯管區(qū)、肝被膜及中央靜脈周圍可見很少量的膠原纖維呈藍(lán)色；NAFLD組大鼠肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍見明顯膠原纖維增多并向周圍放射，未見假小葉形成；而L6H4組大鼠肝組織匯管區(qū)及中央靜脈膠原纖維明顯減少，見圖1D-F。

2.3 各組大鼠肝組織T-SOD活力及MDA含量測(cè)定結(jié)果 與control比，NAFLD組大鼠肝組織T-SOD活力明顯降低，而脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA含量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NAFLD組相比，L6H4組大鼠肝組織T-SOD活力明顯升高，而MDA含量明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明姜黃素衍生物L(fēng)6H4具有抗氧化性，見圖2。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色及Masson染色

圖2 各組大鼠肝組織SOD活力及MDA含量測(cè)定結(jié)果

2.4 各組大鼠肝組織SIRT1、DRP1、MFN2的mRNA表達(dá) 與control組比，NAFLD組大鼠肝臟組織DRP1 mRNA表達(dá)量明顯升高，而SIRT1及MFN2 mRNA表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與NAFLD組比，L6H4大鼠DRP1 mRNA表達(dá)量明顯降低，SIRT1及MFN2 mRNA表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.5 各組大鼠肝組織SIRT1、DRP1、MFN2的蛋白表達(dá) 與control組比，NAFLD組大鼠肝臟組織DRP1蛋白表達(dá)量明顯升高，而SIRT1及MFN2蛋白表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與NAFLD組相比，L6H4組大鼠DRP1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而SIRT1及MFN2蛋白表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

3 討論

圖3 各組大鼠肝組織mRNA表達(dá)結(jié)果

目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但以“二次打擊”學(xué)說為基礎(chǔ)的“多重打擊”理論被大多數(shù)的學(xué)者所接受[6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的脂質(zhì)和碳水化合物的代謝在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[7]，高脂飲食可降低肝組織中SIRT1的表達(dá)，減少肝細(xì)胞中脂肪酸氧化，從而增加脂肪生成和細(xì)胞內(nèi)的沉積[8]，而過表達(dá)SIRT1則能夠延緩NAFLD的進(jìn)展[9]。本研究結(jié)果顯示NAFLD模型肝組織內(nèi)SIRT1的表達(dá)量明顯降低，而且外周血中TG和LDL-C升高、HDL-C降低。此結(jié)果與TOBITA等[8]的研究結(jié)果類似。COLAK等[9]認(rèn)為SIRT1可降低肝細(xì)胞的胰島素抵抗，改善肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，從而減少脂肪生成和細(xì)胞內(nèi)的沉積。姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)治療后，NAFLD大鼠肝組織內(nèi)SIRT1的表達(dá)量明顯升高，肝組織的脂肪變性和膠原纖維的沉積明顯改善，同時(shí)外周血中HDL-C增高，TG和LDL-C降低。表明姜黃素衍生物L(fēng)6H4改善肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，減輕肝細(xì)胞的脂肪變性。其機(jī)制與可能其上調(diào)NAFLD大鼠肝組織內(nèi)SIRT1的表達(dá)，從而降低肝細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗，改善肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝有關(guān)。

圖4 各組大鼠肝組織蛋白表達(dá)結(jié)果

SOD和MDA是公認(rèn)的監(jiān)測(cè)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志。SOD活力減弱，MDA含量增加提示氧化應(yīng)激增強(qiáng)。在NAFLD發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是重要的病理生理基礎(chǔ)[10]。本研究結(jié)果表明姜黃素衍生物L(fēng)6H4能降低NAFLD模型大鼠肝臟的氧化應(yīng)激損傷。最近的研究表明，在高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型中，SIRT1可提高SOD的表達(dá)及活性，從而抵抗氧化應(yīng)激損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素衍生物L(fēng)6H4不僅增加肝組織SIRT1的表達(dá)和SOD活性，而且降低肝組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA含量，減少M(fèi)DA對(duì)細(xì)胞的毒性作用。提示姜黃素衍生物L(fēng)6H4具有“雙重”抗氧化應(yīng)激的作用。其機(jī)制可能是姜黃素衍生物L(fēng)6H4提高NAFLD模型大鼠肝細(xì)胞中的SIRT1的表達(dá)，一方面通過脫乙酰基活化，提高SOD的表達(dá)及活性；另一方面通過減少肝細(xì)胞脂質(zhì)的沉積，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA。

近年來氧化應(yīng)激與線粒體功能的關(guān)系受到普遍關(guān)注，線粒體的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而線粒體的結(jié)構(gòu)是由線粒體的融合及分裂的平衡來維持的。在哺乳動(dòng)物中DRP1是線粒體分裂的重要執(zhí)行分子，而MFN2是線粒體融合的主要執(zhí)行分子，兩者的作用平衡是保證線粒體功能的關(guān)鍵[12]。在病理狀態(tài)下，ROS主要產(chǎn)生于線粒體，ROS增多，線粒體分裂增加，引起線粒體凋亡的發(fā)生[13]。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：棕櫚酸使肝細(xì)胞DRP1表達(dá)增加，MFN2表達(dá)減少；姜黃素衍生物L(fēng)6H4干預(yù)后則明顯減少棕櫚酸環(huán)境中肝細(xì)胞的DRP1的表達(dá)，從而抑制線粒體的分裂及其下游線粒體凋亡途徑的信號(hào)傳導(dǎo)[14]。近期研究表明，SIRT1參與調(diào)控了多種與線粒體增殖的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及活性，從而對(duì)線粒體數(shù)量及質(zhì)量調(diào)節(jié)起重要作用[15-18]。本研究檢測(cè)了SIRT1、DRP1和MFN2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)姜黃素衍生物L(fēng)6H4能明顯提高高脂誘導(dǎo)NAFLD模型大鼠肝組織內(nèi)SIRT1、MFN2表達(dá)水平，降低DRP1表達(dá)水平。表明姜黃素衍生物L(fēng)6H4可能通過調(diào)節(jié)或激活SIRT1的表達(dá)和活性，促進(jìn)線粒體融合，同時(shí)抑制線粒體分裂，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)NAFLD的保護(hù)作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，姜黃素衍生物L(fēng)6H4可顯著改善NAFLD的進(jìn)展，其機(jī)制可能是通過增加SIRT1的表達(dá)和活性，降低肝細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激、抑制線粒體分裂。代謝調(diào)節(jié)因子SIRT1可能作為NAFLD潛在的藥物治療靶點(diǎn)。

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