楊梅，武俊瑞，彭秀明，王駿逸，劉彪，岳喜慶

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866）（2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050）

牛乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠很好的被人體消化和吸收。牛乳中所含有的功能性營(yíng)養(yǎng)成分不僅可以促進(jìn)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育，還能夠提高機(jī)體的免疫能力，被廣泛應(yīng)用在乳制品及功能性產(chǎn)品中[1～3]。乳蛋白是牛乳中的最重要的成分之一，其含量約為3.0%～3.7%，是目前人類膳食蛋白質(zhì)的重要來源[4～5]。牛乳中的蛋白質(zhì)含有人體生長(zhǎng)發(fā)育所需要的全部必需氨基酸，數(shù)量充足，比例適當(dāng)，能夠維持人體的健康[6]。牛乳中的蛋白質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且這些蛋白存在多種潛在的生物學(xué)功能。因此，牛乳蛋白是評(píng)價(jià)牛乳質(zhì)量的重要指標(biāo)。牛乳蛋白可以分為乳脂肪球膜（Milk fat globule membranes, MFGM）蛋白、乳清蛋白、酪蛋白、乳粒蛋白，這些蛋白質(zhì)在組成上各不相同[7-9]。

乳脂肪球（MFG）是以一種微小的球狀物存在于乳中，其直徑大約為0.2～15.0 μm，外面被一層很薄的膜包圍，這層膜被稱之為乳脂肪球膜（MFGM）[10]。MFGM中含有25%～60%的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)占牛乳中總蛋白的1%～2%左右[11～12]。牛乳中的MFGM蛋白具有抗癌[13～15]、降低膽固醇[16～17]、防止幽門螺桿菌感染[18]、提高腦脊髓炎自身免疫[19]等作用。

乳清蛋白約占牛乳蛋白質(zhì)的20%左右，而乳清中的蛋白質(zhì)主要包括：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、蛋白酶、免疫球蛋白等[20]。由于乳清蛋白具有較高的吸收性、完整的氨基酸成分、低脂肪、低膽固醇，還濃縮了牛乳中大多數(shù)的營(yíng)養(yǎng)成分，不僅能夠促進(jìn)身體健康，還可以抗衰老、促進(jìn)心臟健康、抗癌、提高免疫力、提高骨質(zhì)和控制體重，是目前最食用的蛋白質(zhì)補(bǔ)充產(chǎn)品[21-22]。而酪蛋白能夠防止鈣的流失和沉淀，并且能夠幫助人體更好吸收鈣元素。

乳粒是來源于細(xì)胞分泌的直徑為40～100 nm內(nèi)吞作用的膜囊泡[23]。乳粒中主要含有蛋白質(zhì)、脂肪、mRNA、miRNA，這些物質(zhì)能夠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)并賦予細(xì)胞新的功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。乳粒作為細(xì)胞外的細(xì)胞器，在細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞、免疫功能以及作為疾病的生物標(biāo)記物的來源上具有重要的作用[25]。而乳粒蛋白作為乳粒的主要成分之一，同樣具有非常重要的作用。

近年來，對(duì)牛乳的研究主要是集中在乳清蛋白，而對(duì) MFGM 蛋白以及乳粒蛋白的研究卻很少，對(duì)這些蛋白進(jìn)行深入的研究不但能夠提高牛乳的利用率，還能夠了解牛乳中蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。因此，本研究利用SDS-PAGE電泳將牛乳中的MFGM蛋白、乳清蛋白、乳粒蛋白進(jìn)行分離，并經(jīng)過酶解后質(zhì)譜鑒定，將鑒定后的結(jié)果通過GO功能注釋以及KEGG代謝通路分析，深入了解牛乳中不同部分蛋白質(zhì)的組成及功能差異。

1 材料與方法

1.1 原料

采集30份健康奶牛的牛乳并在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行混合，由沈陽輝山乳業(yè)奶牛場(chǎng)提供。

牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，上海雅心生物有限公司；丙酮、Na2HPO4、NaH2PO4、冰醋酸、考馬斯亮藍(lán) G-250、DTT、碳酸氫銨、甲酸、乙腈，北京鼎國(guó)生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)，上海翼悾機(jī)電有限公司；超聲波清洗器，北京佳源興業(yè)科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；小型垂直電泳槽：美國(guó) Bio-Rad公司；毛細(xì)管高效液相色譜，美國(guó)Agilent；LTQ VELOS質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛乳中不同部分蛋白質(zhì)提取[7,26]

取50 mL乳樣，在4 ℃，10000 r/min離心15 min，分離獲得乳脂肪部分（MFGM）和下層乳清、乳粒部分。將上層的乳脂肪用 PBS清洗三次，每次清洗時(shí)80 W超聲15 min。將清洗后的乳脂部分在4 ℃，12000 r/min離心30 min，收集上層樣品，即為MFGM樣品，然后加入適量預(yù)冷的丙酮沉淀，收集 MFGM 蛋白樣品，凍干待用。下層的樣品即乳清、乳粒部分，繼續(xù)在4 ℃，12000 r/min離心45 min，收集上清樣品，沉淀即為乳粒樣品的粗提物。上清樣品利用等電點(diǎn)法除去酪蛋白后，即為乳清部分。加入適量預(yù)冷的丙酮沉淀，收集乳清蛋白樣品，凍干待用。

將乳粒粗提物加入10 mL PBS重懸，在4 ℃，12000 r/min離心45 min收集沉淀，此過程重復(fù)三次，清洗過后的沉淀即為乳粒。將乳粒加入適量預(yù)冷的丙酮沉淀，收集乳粒蛋白樣品，凍干待用。

1.3.2 牛乳中不同部分蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分析

將提取的MFGM、乳清、乳粒蛋白分別加入裂解液（含8 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS）并置于冰盒上裂解，裂解后的蛋白利用Bradford法進(jìn)行定量，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[27]。分別取10 μL上樣，采用5%的濃縮膠、12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳[28]。

1.3.3 蛋白樣品酶解

每組樣品取200 μg進(jìn)行酶解，使用HU buffer調(diào)整樣品體積為40 μL。加入DTT至終濃度為10 mM，37 ℃孵育1.5 h后加入IAA至終濃度50 mM，600 r/min振蕩1 min，避光室溫30 min。每個(gè)樣本加入100 μL 25 mM碳酸氫銨溶液，混勻后加入2 μg的Lysyl C，室溫反應(yīng)3小時(shí)。再向反應(yīng)體系中加入250 μL 25 mM碳酸氫銨溶液，加入 10 μL Trypsin（20 μg Trypsin in 50 μL Dissolution buffer），600 r/min 振蕩 1 min，37℃ 16 h，使用C18柱進(jìn)行脫鹽，脫鹽樣本取1 μL進(jìn)行MALDL TOF質(zhì)譜分析。樣本脫鹽凍干之后使用0.1%的FA復(fù)溶，OD280肽段定量，取3 μg樣本進(jìn)行后續(xù)ESI質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 毛細(xì)管高效液相色譜

液相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱0.15 mm*150 mm（RP-C18）（Column Technology Inc.）以95%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到 Zorbax 300SB-C18 peptide traps（Agilent Technologies, Wilmington, DE），再經(jīng)色譜柱分離，相關(guān)液相梯度如下：0 min-50 min，B液線性梯度從4% 到50%；50 min-54 min，B液線性梯度從50% 到100%；54 min-60 min，B液維持在100%。

1.3.5 ESI質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析

酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜脫鹽及分離后用LTQ VELOS質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan, San Jose, CA）進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)樣方式：Microspray，毛細(xì)管溫度：200度，檢測(cè)方式：正離子。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）。

利用Proteme Discoverer 1.4和Sequest軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。搜索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為 uniprot，結(jié)果過濾參數(shù)為：charge=1，XCorr≥1.5 ； charge=2 ， XCorr≥2.0 ； charge=3 ，XCorr≥2.25，Delta cn＜0.1。

1.3.6 GO功能注釋及KEGG代謝通路分析

Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)包含了生物過程（Biological Process）、分子功能（（Molecular Function）和細(xì)胞組成（Cellular Component）三方面的功能信息。利用DAVID Bioinformatics Resources在線工具進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)查詢及檢索，得到GO功能信息及KEGG代謝通路結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE電泳結(jié)果分析

圖1 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE chart of MFGM，whey, exosome protein in milk

將提取的牛乳中 MFGM 蛋白、乳清蛋白、乳粒蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析[9]，結(jié)果如圖1所示。由牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分的電泳圖可以看到，蛋白質(zhì)在組成及含量上并不完全相同。而MFGM、乳清、乳粒蛋白中酪蛋白含量較高，掩蓋了一些低豐度蛋白的表達(dá)，可能是由于酪蛋白存在于MFGM、乳粒中[29]。在牛乳中MFGM、乳清、乳粒含有一些相同表達(dá)蛋白，如果將MFGM、乳粒蛋白充分利用在乳制品加工中能夠增加牛乳的利用率與利用價(jià)值。

2.2 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分酶解后的鑒定結(jié)果分析

圖2 A1YQB2-DDQNPHSSNICNISCD的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Two stage mass spectrometry of the A1YQB2-DDQNPHSSNICNISCD

圖3 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白組成Fig.3 Compositions of MFGM，whey, exosome protein in milk

將牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分酶解后的肽段進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，然后進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。研究表明，具有Unique Peptides完整肽段的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果具有極高的可信度[30]。圖 2所示是 Uniprot登錄號(hào)為A1YQB2（α-乳白蛋白）的二級(jí)質(zhì)譜圖。本文中牛乳蛋白的Unique Peptides≥1的總共鑒定出244種蛋白，其中牛乳的Unique Peptides最多可達(dá)到43種，說明本實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果具有較高的可信度。如圖3所示，MFGM鑒定出201種，乳清鑒定出96種，酪蛋白鑒定出21種，乳粒中鑒定出43種。結(jié)果表明，MFGM蛋白質(zhì)的種類明顯高于乳清、乳粒蛋白。雖然乳清蛋白是目前應(yīng)用最為廣泛的乳制品原料，但是MFGM、乳粒作為原料同樣具有較高的利用價(jià)值。

2.3 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分組成對(duì)比分析

圖4 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的維恩圖Fig. 4 The Venn diagram of MFGM，whey, exosome protein in milk

如圖4所示，有27種蛋白質(zhì)在這三部分都有表達(dá)，MFGM中有140種特異性表達(dá)蛋白，乳清中有33中特異性表達(dá)蛋白，乳粒中有3種特異性表達(dá)蛋白。這也說明，牛乳中MFGM、乳清、乳粒在蛋白質(zhì)組成上并不完全相同，而 MFGM 蛋白中含有特異性表達(dá)蛋白種類較多。這與Timothy的分類及比較方法類似，從不同角度詮釋的牛乳中蛋白質(zhì)的組成[7]。因此對(duì)牛乳中不同組成部分蛋白質(zhì)的組成進(jìn)行深入研究，能夠?yàn)槿蘸罄肕FGM、乳粒蛋白為原料生產(chǎn)乳制品提供理論依據(jù)。

2.4 GO功能注釋分析

2.4.1 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分參與的生物過程分析

如圖5所示，通過對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，選擇主要的生物過程。牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的生物過程主要是生物調(diào)控（biological regulation）、細(xì)胞組成（cellular component）、細(xì)胞定位（localization）、細(xì)胞定位的建立（establishment of localization）、傳導(dǎo)（transport），而牛乳中酪蛋白主要參與細(xì)胞定位、細(xì)胞定位的建立以及傳導(dǎo)。通過對(duì)生物過程的分析可知，牛乳中 MFGM 蛋白在生物過程中發(fā)揮的作用要高于乳清和乳粒蛋白，尤其體現(xiàn)在生物調(diào)控中的作用。Timothy同樣將乳中不同部分蛋白質(zhì)進(jìn)行生物過程歸類分析，并進(jìn)行比較，分析了不同部分蛋白質(zhì)在生物過程中發(fā)揮作用的差異[7]。

圖5 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的生物過程Fig. 5 Biological processes of MFGM，whey, exosome protein in milk

2.4.2 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分參與的分子功能分析

圖6 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的分子功能Fig.6 Molecular Function of MFGM，whey, exosome protein in milk

如圖6所示，牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的分子功能主要為結(jié)合（binding）、酶調(diào)節(jié)活性（enzyme regulator activity）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）、抗氧化活性（antioxidant activity）、蛋白二聚體活性（protein dimerization activity），酪蛋白主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)活性和抗氧化活性。其中結(jié)合作用是牛乳中不同部分蛋白質(zhì)的主要的分子功能，而 MFGM 蛋白質(zhì)的結(jié)合作用最高，可能MFGM蛋白參與膜的結(jié)合作用有關(guān)。而乳粒蛋白參與的轉(zhuǎn)運(yùn)活性分子功能高于MFGM、乳粒蛋白，可能與乳粒的轉(zhuǎn)運(yùn)作用有關(guān)。

2.4.3 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分的細(xì)胞組成分析

如圖 7所示，牛乳中 MFGM、乳清、乳粒蛋白主要參與的細(xì)胞組成為膜（membrane）、細(xì)胞內(nèi)部分（intracellular part）、細(xì)胞外部分（extracellular region）、蛋白質(zhì)-脂類復(fù)合物（protein-lipid complex）、細(xì)胞表面（cell surface），而酪蛋白主要參與細(xì)胞外部分。其中乳粒蛋白參與較多的細(xì)胞組成為膜，這與乳粒本身為膜囊泡有關(guān)。 與乳清、乳粒蛋白相比MFGM 蛋白參與的細(xì)胞組成均較多，這也說明了MFGM蛋白具有較高的利用價(jià)值。

圖7 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白參與的細(xì)胞組成Fig.7 Cellular Component of MFGM，whey, exosome protein in milk

2.5 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分的 KEGG代謝通路分析

如表1，表2所示，牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分中有22種蛋白參與KEGG代謝通路，包括：過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）、補(bǔ)充和凝血結(jié)合（Complement and coagulation cascades）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）、囊泡運(yùn)輸中SNARE相互作用（SNARE interactions in vesicular transport）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-term potentiation）。MFGM 蛋白參與的代謝通路為PPAR信號(hào)通路、囊泡運(yùn)輸中SNARE相互作用、鈣信號(hào)通路、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；乳清蛋白與的代謝通路為 PPAR信號(hào)通路、補(bǔ)充和凝血結(jié)合、半乳糖代謝；乳粒蛋白參與的代謝通路為 PPAR信號(hào)通路。MFGM、乳清、乳粒蛋白均參與的代謝通路為 PPAR信號(hào)通路，如圖8所示。這也是從代謝角度說明了牛乳中不同部分蛋白質(zhì)組成有相同的一部分，也有較多的不同。

圖8 MFGM、乳清、乳粒蛋白均參與的PPAR信號(hào)通路Fig. 8 Proteins involved in PPAR signaling pathway of different component protein parts in milk

表1 牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分的KEGG代謝通路Table 1 KEGG Pathway of the different component protein parts in milk

表2 參與KEGG代謝通路的蛋白Table 2 Proteins involved in KEGG pathway

P11151 脂蛋白脂酶 478 53.3 8.51 Q32PA1 CD59分子，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白 121 13.7 7.75 A6QPX7 纖維蛋白原β蛋白 330 37.9 6.68 Q3SZZ9 纖維蛋白原γ蛋白 435 49.1 5.87 P34955 α-1-抗蛋白酶 416 46.1 6.52 Q3T000 突觸同源YKT6蛋白 198 22.5 6.58 Q2T9M8 突觸相關(guān)蛋白同種型SNAP23A 211 23.2 4.83 Q0II86 突觸相關(guān)蛋白 258 28.5 5.47 P04896 鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白 394 45.7 5.71 Q3SYS6 鈣調(diào)磷酸酶B同源蛋白 195 22.4 5.10 Q08E45 鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IIα 478 54.1 7.08 P38408 鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基 355 41.5 6.07 P30546 組胺H1受體 491 55.9 8.97 P61223 Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-1b蛋白 184 20.8 5.78 P08037 β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶 402 44.8 9.31 P00711 α-乳清蛋白 142 16.2 5.14

3 結(jié)論

3.1 牛乳中 MFGM、乳清、酪蛋白、乳粒中的蛋白質(zhì)在組成及含量上存在一定的差異，MFGM中鑒定出201種蛋白質(zhì)，乳清中鑒定出96種蛋白質(zhì)，酪蛋白中鑒定出21種蛋白，乳粒中鑒定出33種蛋白質(zhì)。其中只有27種相同的蛋白，說明牛乳中不同部分蛋白組成存在較大的差異。通過分別對(duì)MFGM、乳清、酪蛋白、乳粒中的蛋白質(zhì)的GO功能注釋及KEGG代謝通路分析表明，牛乳中MFGM、乳清、酪蛋白、乳粒中的蛋白質(zhì)在生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成及代謝通路上同樣存在較大的差異。其中，MFGM蛋白參與的功能及代謝通路要高多于乳清與乳粒，這說明牛乳MFGM蛋白具有較高的利用價(jià)值，可能會(huì)作為原料為日后生產(chǎn)乳制品提供參考依據(jù)。對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)不同組成部分進(jìn)行探究，能夠深入的了解牛乳中的蛋白質(zhì)分布情況，以及不同組成部分蛋白質(zhì)的功能，有利于提高牛乳的利用率。然而，通過SDS-PAGE的結(jié)果顯示，MFGM、乳清、乳粒中酪蛋白含量較高，這樣會(huì)影響一些低豐度蛋白的表達(dá)。因此，想要更深入的了解牛乳中不同部分蛋白質(zhì)在組成及含量上的差異還有待更進(jìn)一步的研究。

3.2 目前，母乳并不能完全滿足嬰幼兒的需求，市場(chǎng)上以牛乳為替代品，主要是由于牛乳中乳蛋白的價(jià)值較高。而當(dāng)前主要是以乳清蛋白中幾種功能性蛋白為主，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)單一的乳清蛋白并不能完全滿足嬰幼兒的需要[31]。因此，對(duì)牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白質(zhì)在組成上全面的研究也越來越重要。

通過鑒定結(jié)果可以看出牛乳中不同部分蛋白質(zhì)在組成上差異較大，主要是由于高豐度蛋白的存在，大大影響到了一些低豐度乳蛋白的表達(dá)[32]。

3.3 牛乳中MFGM蛋白質(zhì)的種類明顯高于乳清與乳粒蛋白，這說明 MFGM 蛋白在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的作用可能更加重要，所以對(duì) MFGM 蛋白的加工與利用尤為重要。而乳粒蛋白種類比較低，這可能與乳粒表面的酪蛋白沒有完全除去有關(guān)，掩蓋了乳粒中低豐度蛋白的表達(dá)。MFGM蛋白參與的生物調(diào)控過程較多，說明MFGM 蛋白主要在生物大分子間的相互識(shí)別與相互作用。乳粒蛋白參與的轉(zhuǎn)運(yùn)活性的分子功能較高，這可能與乳粒本身能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。而乳清蛋白在GO功能中的作用較為全面，比例較為適中。牛乳中不同部分蛋白質(zhì)參與的PPAR signaling pathway主要是通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生生物效應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和能量代謝的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。因此牛乳中蛋白質(zhì)參與的 PPAR signaling pathway在機(jī)體內(nèi)起著非常重要的作用。

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