杜 鵬 劉 紅 姚 琦 馬 倩 習(xí) 玉 峰

湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)省重點實驗室，湖北武漢 430062

磁性聚合物微粒是采用一定的合成方法，將具有磁性的物質(zhì)和高分子聚合物反應(yīng)而制成的一種新型聚合物材料。可以獲得具有長血液循環(huán)時間的磁性氧化鐵納米顆粒，也可以通過與特定的配體或受體的偶聯(lián)結(jié)合，從而獲得功能更為復(fù)雜的磁性氧化鐵納米顆粒MRI分子影像探針[1，15]。Fe3O4納米顆粒以其超順磁特性在磁共振成像（MRI）中表現(xiàn)出獨特的造影劑功能，并具有良好的生物安全性和表面可修飾性等諸多優(yōu)點，因此磁性納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)上展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值[2]。造影劑可以增強信號對比度和提高軟組織圖像的分辨率，用于惡性腫瘤的早期診斷及鑒別。在影像醫(yī)學(xué)研究中Fe3O4納米顆粒已成為最受青睞的MRI造影劑[3]。

本實驗室已經(jīng)合成與表征了具有一定超順磁性，粒徑分布均勻的Fe3O4納米微粒，本文中主要選用此顆粒為核心，在其表面偶聯(lián)上99mTc（锝）和RGD小肽，制備SPECT/MRI雙模態(tài)探針。主要考察該雙模態(tài)探針應(yīng)用于裸鼠模型的SPECT/MRI成像，研究其在體內(nèi)體外的靶向行為。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

二亞乙基三胺五乙酸二酐(DTPA二酐)，Tween-20分析純，透析袋（mw，8000～ 14000），均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司；羧基聚乙二醇（mw，2000）（HOOC-PEG-COOH）、氨基聚乙二醇（mw，2000）（HOOC-PEG-NH2）、DMSO 和 RGD小肽（C(RGDyK)）均由炎怡生物技術(shù)公司提供；超凈臺、CO2培養(yǎng)箱，Therome公司；正置熒光顯微鏡DM2500，Leica（德國）公司；3T Trio 磁共振成像儀系統(tǒng)，西門子（德國）公司；SPECT/CT，Bioscan（美國）公司；烘箱LC-213，上海愛斯佩克環(huán)境設(shè)備有限公司；電子天平PB602-N，METELER TOLEDO公司；超聲波清洗器USC-202，上海波龍電子設(shè)備公司；高速離心機Microfuge 16，BECKMAN COULTER公司；動態(tài)光散射（DLS）儀、粒度分析儀Nano-ZS，Malvern公司；γ放射免疫計數(shù)器GC-1200，中佳光電公司；超濾管HyClone（美國）公司；Milli-Q 純水系統(tǒng)制備溶液配置用水。人肺癌H1299細(xì)胞株、裸鼠BALB/C-nu購自上海斯萊克動物實驗有限公司。

1.2 SPECT/MRI雙模態(tài)靶向探針的制備

1.2.1 Fe3O4@PEG-DTPA-RGD的制備及DLS測量顆粒的水力學(xué)尺寸 （1）配制15mL混合液（HOOC-PEG-NH21mL，HOOC-PEG-COOH 1mL，F(xiàn)e3O4透析液2mL（本實驗室準(zhǔn)備），PBS 11mL），超聲1小時。（2）將15mL混合液置于分子量30K的超濾管中，5000rpm，10min，上層約有5mL殘留，加 PBS 5mL，5000rpm，10min，重復(fù) 2次，以除去游離PEG。（3）將殘留液轉(zhuǎn)移至分子量3K的超濾管中，6000rpm，15min，約 2mL 殘留，靜置后有沉淀，上清呈深棕色。（4）以DMSO為溶劑，配制DTPA二酐-DMSO溶液，濃度為1mg/mL。（5）取DTPA二酐-DMSO溶液100μL，加到（3）中殘留液中，振蕩 1min，5000rpm，15min，約 200μL殘 留，加 PBS 3mL，5000rpm，10min，重復(fù) 2次，以除去 DMSO 及游離DTPA，約1mL殘留。（6）取8mLPBS與10mL離心管中，加入2μL Tween-20。（7）稱取20mg NHS、20mg EDC，分別置于2個EP管中，在兩管中各加入400μL（6）中溶液，混勻。（8）從（7）兩管中各取出200μL溶液，加入以新EP管中，再加入 (5)中殘留液（Fe3O4@PEG-DTPA）50μL。（9）渦旋10s，將EP管固定在垂直混合儀上，室溫反應(yīng)15min。（10）將50μg RGD小肽投入（9）溶液中。（11）在37℃中振蕩3小時，反應(yīng)完成后，封口在4℃保存。

1.2.2 99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD （1）稱取 10mg SnCl2，溶于 10mL 10mM 的 HCl溶液，混勻。配制0.25 mM的乙酸銨溶液。（2）取40μL Fe3O4@PEG-DTPA-RGD溶 液，40μL的 0.25 mM乙酸銨溶液，20μL PBS 溶液，10μL Na99 mTcO4溶液，混勻。反應(yīng)一小時，每20min渦旋1min，使其充分反應(yīng)。（3）反應(yīng)結(jié)束后，用薄層色譜法（TLC）檢測探針的放化純度。取1mm×10mm層析紙條，在一端1cm處用鉛筆畫一虛線，在虛線中點3μL樣品，將有虛線一端浸入丙酮中，待丙酮跑到層析條4/5處，取出層析條。將其剪為4段，用表面沾污儀分別檢測者4段的核素活度。見圖1。

圖1 Fe3O4@PEG-DTPA-RGD的制備原理

1.2.3 用動態(tài)光散射（DLS）儀測量顆粒的水力學(xué)尺寸 制備的探針溶液，用PBS（pH=7.4）和超純水稀釋到適量的濃度，分別在在不同的時間點（0h、2h、6h、8h、24h）測量顆粒的水化直徑。見圖 2。

圖2 Fe3O4@PEG-DTPA分別在水中和在PBS中不同時間點的水合直徑

1.3 探針的細(xì)胞靶向性分析

采用Fe3O4@PEG-RGD探針和Fe3O4@PEG與H1299細(xì)胞共培養(yǎng)，時間梯度為1h、2h和3h，探針濃度定為2mM；分為三組：靶向組，加入2mM靶向探針Fe3O4@PEG-RGD共培養(yǎng)；對照組，加入2mM的非靶向探針Fe3O4@PEG共培養(yǎng)；競爭組中，加入濃度為1.5×10-3mg/mL的多肽，加入2mM靶向探針Fe3O4@PEG-RGD的共培養(yǎng)。

將18mm×18mm的蓋玻片在75%中浸泡5s,在火焰上烘干蓋玻片，放入六孔板中（一孔一片）。將生長狀態(tài)良好的H1299細(xì)胞取400μL，滴于蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，加入含指定濃度探針的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至指定時間，吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗三次，進行普魯士藍(lán)染色。具體操作如下：細(xì)胞普魯士藍(lán)染色：利用三價鐵與亞鐵氰化鉀在酸性條件下反應(yīng)，能夠生成普魯士藍(lán)，來定性分析細(xì)胞對納米鐵粒子的吞噬情況。將細(xì)胞鋪板，并照上面過程共培養(yǎng)并處理后，采用4%的多聚甲醛固定10min，吸出固定液后風(fēng)干15min，再用 PBS 浸泡5min。加入 10%的 Prussian blue (K4Fe(CN)63H2O)浸 泡 5min，再 用 Prussian blue (K4Fe(CN)63H2O)和20% HCl （1：1）混合液浸泡45min，用水浸泡5min。用核固紅染 15min。然后依次用75%，95%，100%乙醇（2次）梯度脫水并風(fēng)干，用二甲苯浸泡玻片，并最終用中性樹脂封片。待晾干后置于顯微鏡下（LEICA DM2500）觀察拍片[4]。

1.4 探針的SPECT/MRI成像實驗[5-6]

在15只BALB/C-nu裸鼠右上肢腋下皮下接種人H1299細(xì)胞株，細(xì)胞液用量200μL,約含腫瘤細(xì)胞3×107個。接種后約2周，腫瘤直徑長至約1.0cm時用于實驗。

（1）SPECT/CT成像：取5只已建立腫瘤模型的BALB/C-nu裸鼠，分為三組：靶向組、競爭組和對照組。尾靜脈注射探針，靶向組每只注射900uci99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針（200μL）；競爭組每只提前15min注射100mg RGD，然后每只注射900uci99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針（200μL）；對照組每只注射900uci99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG探針（200μL），探針注射后分1h、3h成像。

NanoSPECT/CT每只小鼠在進行SPECT顯像之前首先進行CT掃描，CT掃描參數(shù)選取256×512的幀分辨率、45 kVp的球管電壓和0.15 mA電流以及500 ms/幀的曝光時間，小鼠全身掃描時間約為7分鐘，在采集圖像的同時通過Nucline 1.02軟件（匈牙利Mediso公司）進行實時圖像3D重建。CT掃描結(jié)束后，進行同機SPECT掃描，SPECT掃描選用4個高分辨9孔板配合錐形準(zhǔn)直器同時實現(xiàn)圖像的高分辨及高靈敏度，能峰選擇140KeV，窗寬10%，掃描參數(shù)選擇1 mm/pixel的分辨率及 256 × 256的矩陣排列以及24個投影和60s/投影的掃描時間，小鼠全身掃描約需33分鐘，掃描完成后，圖像通過InVivoScope 1.44軟件（美國Bioscan公司）進行3D-OSEM重建，重建算法選擇4個子集及6次迭代計算，重建分辨率為0.4 mm/pixel。見圖4。（2）MRI成像：取9只已建立腫瘤模型的BALB/C-nu裸鼠，分為三組：靶向組、競爭組和對照組。尾靜脈注射探針，靶向組每只注射200μL99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針（含鐵0.5mg）；競爭組每只提前15min注射100mg RGD，然后每只注射200μL 99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針（含鐵0.5mg）；對照組每只注射200μL Fe3O4@PEG探針（含鐵 0.5mg）。

探針注射后3h ，上機檢測前，每只裸鼠注射150μL麻醉劑（8%水合氯醛：氯胺酮=2：13，v/v）。分別采用T1加權(quán)和T2加權(quán)序列成像，參數(shù)如下：T1加權(quán)自旋回波序列：TR=500ms，TE=10ms，F(xiàn)OV=75×100mm2，data matrix=192×256，slice thickness=2mm，掃描4次；T2加權(quán)自旋回波序列：TR=1500ms，TE=83ms，F(xiàn)OV=75×100mm2，data matrix=192×256，slice thickness=2mm，掃描 4次。

1.5 裸鼠體內(nèi)核素濃度測定及腫瘤組織中探針的分布

SPECT/CT成像結(jié)束后，將5只裸鼠斷頸處死，取下全身各主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉）和腫瘤，γ放射免疫計數(shù)器測量上述器官中殘余的核素濃度，除以成像實驗前注射的總的核素濃度，再除以該器官的質(zhì)量，即可得到ID/g%。

MRI成像結(jié)束后，將9只裸鼠斷頸處死，取下腫瘤組織，放于-80℃保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@PEG-DTPA顆粒分別在水中和在PBS中不同時間點的水合直徑

由圖2可知，F(xiàn)e3O4@PEG-DTPA在水中和PBS中的DLS圖譜峰型較單一，特別是在PBS中，各峰的重合度較好。Fe3O4@PEG-DTPA在PBS中的水合粒徑為120nm，F(xiàn)e3O4@PEG在PBS中的水合粒徑為100nm，二者相差20nm，說明DTPA成功與Fe3O4@PEG偶聯(lián)。分散系數(shù)在0.3左右，說明Fe3O4@PEG-DTPA在兩種溶劑中的單分散穩(wěn)定性較好。

表1 99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針在裸鼠各主要器官的殘余核素活度

2.2 探針的細(xì)胞靶向性分析結(jié)果

放化純度的測定顯示99mTc的標(biāo)記率在90%左右，說明標(biāo)記良好。

H1299細(xì)胞對靶向探針的吞噬量要高于非靶向探針的吞噬量。游離多肽RGD的加入能夠一定程度上抑制細(xì)胞對靶向探針的吞噬。對照組b、e和h顯示，細(xì)胞對非靶向探針的吞噬量隨時間增加。

游離多肽RGD的加入能與靶向探針競爭細(xì)胞表面的受體，抑制細(xì)胞對靶向探針的吞噬，在與游離多肽RGD共培養(yǎng)1小時，2小時與3小時后細(xì)胞對探針的吞噬從競爭組f、i來看沒有明顯差異。說明在短期內(nèi)游離多肽RGD對靶向探針的抑制作用明顯。

圖3 H1299細(xì)胞與99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針在不同時間共培養(yǎng)下普魯士藍(lán)染色結(jié)果

2.3 SPECT/CT成像結(jié)果及分析

在注射探針1小時后，靶向組（圖4a）可看出腫瘤部位。競爭組（圖4d）中能看出腫瘤部位，該腫瘤中心已經(jīng)壞死，而且探針主要分布在腫瘤的表面。在注射探針三小時后，靶向組（圖4c）的腫瘤部位在圖中沒有顯示。而在競爭組（圖3d）中腫瘤的中心部位有少量探針，說明隨著時間的增加，探針隨著體內(nèi)代謝而排出體外。

由表1可以看到99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEGDTPA-RGD探針在肝、腎、肺部積蓄較多。說明當(dāng)探針注射到體內(nèi)后，被肝臟吞噬較多。

圖4 99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPARGD探針在裸鼠SPECT/CT成像圖

2.4 MRI成像結(jié)果及分析

圖5顯示出，靶向組、競爭組和對照組之間的成像有差異，尤其是在T2加權(quán)成像中，在靶向組f圖中出現(xiàn)的黑色區(qū)域是三組中最廣的，競爭組g圖其次，對照組h最少。說明99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEGDTPA-RGD探針能在腫瘤部位富集，提高了信號強度，有一定的靶向性。比較靶向組與Pre-injection的圖片，b圖中的腫瘤部位比a圖中的腫瘤部位亮度要高；f圖中的腫瘤部位比e圖中的腫瘤部位的邊緣部位要暗。在f、g和h圖中，腫瘤部位出現(xiàn)不同程度的暗區(qū)，說明該探針具有較好的T2成像效果。在b圖和d圖中腫瘤的邊緣部位的亮度有稍有加強，T1成像效果也很明顯，99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD探針具有T1造影潛能。

圖5 99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPARGD探針在裸鼠MRI成像圖

3 討論

制備的99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD雙模態(tài)探針，通過修飾納米顆粒，在表面偶聯(lián)上共聚物等高分子材料與現(xiàn)有的小分子造影劑相比，其有著更高的體內(nèi)安全性和檢測靈敏度，已成為構(gòu)建新型MRI造影劑的首選材料[7]。

多肽RGD能夠與細(xì)胞表面的αvβ3受體特異性結(jié)合，并通過整合素-親和素強相互作用被細(xì)胞吞噬。游離多肽RGD的加入能夠一定程度上抑制細(xì)胞對靶向探針的吞噬[8]，這種競爭作用在短時間內(nèi)作用明顯，在較長時間內(nèi)的競爭作用還需驗證。

在體內(nèi)腫瘤成像實驗中，探針的靶點主要是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達αvβ3受體，在SPECT/CT成像以及MRI成像中，腫瘤邊緣的信號強于腫瘤的中心區(qū)域，說明新生血管在腫瘤內(nèi)部分布不均勻，邊緣新生血管豐富而內(nèi)部缺血，細(xì)胞大量壞死[9-10]。ID/g%的分布實驗同樣也證明了靶向探針具有良好的靶向性，能在腫瘤部位富集。

在MRI成像中，縱向弛豫時間T1、橫向弛豫時間T2是基本物理量，能定量反映組織弛豫特性。在主磁場固定的情況下，組織的弛豫特性基本穩(wěn)定。通過測量腫瘤組織弛豫時間可以定量的評價腫瘤組織特性，有助于腫瘤的診斷以及評估患者的療效和預(yù)后[11]。磁共振造影劑在靶組織內(nèi)大量聚集，提高水中質(zhì)子的弛豫速率，從而增強正常與病變組織之間的磁共振信號對比度，提高成像分辨率，可分為T1造影劑和T2造影劑[12]。T1造影劑可以提供亮信號，超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIOs)是經(jīng)典的T2造影劑，它的最大的缺點在于其固有的陰性造影效果和磁敏感偽影，T1-T2雙模成像策略在這一需求下應(yīng)運而生，力求提供互補的成像信息以提高診斷的精確性。磁性納米顆粒不僅具有優(yōu)良的磁學(xué)性質(zhì)，也具有良好的的生物安全性和表面可修飾性，因此基于磁性納米顆粒的雙模造影劑已成研究熱點[13-14]。

本實驗三個組在注射探針后T2加權(quán)成像中，腫瘤邊緣部位均出現(xiàn)不同程度的暗斑，說明探針能作為T2造影劑。在T1加權(quán)成像中，腫瘤的邊緣部位比在探針注射前亮度有所提升。因此，制備的99mTc標(biāo)記Fe3O4@PEG-DTPA-RGD雙模態(tài)探針既具備T2造影能力，又具有T1造影潛能。同時，其新穎的結(jié)構(gòu)為雙模造影劑的設(shè)計提供了新思路。

[參考文獻]

[1] Portney NG，Ozkan M.Nano-oncology：drug delivery，imaging，and sensing[J].Anal Bioanal Chem，2006， 384（3）：620-630.

[2] Liu Z，Kiessling F，Gtjens J.Advanced nanomaterials in multimodal imaging：design， functionalization and biomedical applications[J].Journal of Nanomaterials，2010，（1）：51-57.

[3] 周暉，吳俊嬌，范潔琳.多模態(tài)分子影像技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的研究進展[J].中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2011，19（10）：794-796.

[4] Xie H，Zhu Y，Jiang W，et al.Lactoferrin-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a specific MRI contrast agent for detection of brain glioma

[5] Sun N，Chen DX，Gu HC，et al.Experimental study on T2 relaxation time of protons in water suspensions of iron-oxide nanoparticles: waiting time dependence. Journal of magnetism and magnetic materials [J].2009，321（18）：2971-2975.

[6] Lee S，Chen X.Dual-modality probes for in vivo molecular imaging[J].Molecular imaging，2009，8（2）：87-91.

[7] 喬瑞瑞，曾劍鋒，賈巧娟，等.磁性氧化鐵納米顆粒-通向腫瘤磁共振分子影像的重要基石[J].物理化學(xué)學(xué)報，2012，28（5）：993-1011.

[8] Liu TH，Chang G，Cao RJ，et al.Applications of superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles in magnetic resonance imaging[J].Progress in Chemistry，2015，27（5）：601-613.

[9] Su HY，Wu CQ，Li DY，et al.Self-assembled superparamagnetic nanoparticles as MRI contrast agents [J].Chinese Physics B，2015，24（12）：891-895.

[10] Sapsford KE，Algar WR，Berti L，et al.Functionalizing Nanoparticles with Biological Molecules: Developing Chemistries that Facilitate Nanotechnology[J].Chemical reviews，2013，113（3）：1904-2074.

[11] 古冬連，金觀橋，蘇丹柯.磁共振弛豫時間T1、T2的測量方法及其在腫瘤中的應(yīng)用價值[J].廣西醫(yī)學(xué)，2017，39（5）：686-688.

[12] 黃國明.基于磁性納米材料的高性能磁共振成像造影劑的合成及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究[D].廈門大學(xué)，2014.

[13] 王巧英，曾曉霞，祝青，等.磁共振造影劑的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2013，13（16）：3186-3189.

[14] Liu W，Dahnke H，Rahmer J，et al.Ultrashort T2* relaxometry for quantitation of highly concentrated superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticle labeled cells[J].Magnetic Resonance in Medicine Official Journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine，2010，61（4）：761-766.

[15] Scharlach C，Warmuth C，Schellenberger E.Determination of blood circulation times of superparamagnetic iron oxide nanoparticles by T2* relaxometry using ultrashort echo time (UTE) MRI [J].Magnetic Resonance Imaging，2015，33（9）：1173-1178.