陽毅敏，潘靈韜，莊浩瀚，孫洪超，楊怡，陳學(xué)秋，杜愛芳

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，杭州310058）

隱孢子蟲是一種可以引起嚴(yán)重腹瀉疾病的頂復(fù)門寄生蟲，在世界范圍內(nèi)分布廣泛[1]。隱孢子蟲病流行于許多資源匱乏的國家，并且可以在工業(yè)化國家娛樂用水中爆發(fā)[2]。該疾病自限于免疫健全的宿主，但可使免疫力低下的個體虛弱，甚至致命，尤其是在資源有限地區(qū)未經(jīng)治療的艾滋病患者[3]和營養(yǎng)不良的兒童[1]。隱孢子蟲是亞洲和非洲幼兒大多數(shù)中到重度腹瀉病的4種病原體之一，是造成這些兒童腹瀉和死亡的第2大病因[4]。盡管如此，目前仍缺乏有效的治療措施[5]，因此迫切需要鑒定出能夠開發(fā)新型干預(yù)措施的分子靶點(diǎn)。

參與介導(dǎo)隱孢子蟲和宿主細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)是干預(yù)隱孢子蟲病的潛在靶標(biāo)，但是已被表征的很少。隱孢子蟲在體外難以繁殖和進(jìn)行遺傳操作，阻礙了新分子靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證[6-7]。盡管如此，許多研究已經(jīng)證明，黏蛋白樣糖蛋白和凝集素在介導(dǎo)體外和體內(nèi)隱孢子蟲感染中發(fā)揮了重要的作用[8-9]。隱孢子蟲黏附和入侵過程的特征表明，這種寄生蟲可能遵循所發(fā)現(xiàn)的其他頂復(fù)門寄生蟲黏附和入侵的機(jī)制[10]。在與宿主細(xì)胞接觸后，特有的頂端復(fù)合體細(xì)胞器（棒狀體、致密顆粒和微線體）釋放參與宿主細(xì)胞識別和黏附的抗原，入侵并形成納蟲空泡[11]。與其他頂復(fù)門原蟲不同的是，黏蛋白樣糖蛋白可能參與了隱孢子蟲的這些過程。黏蛋白是由20%～55%絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基組成的糖蛋白，由于絲氨酸和蘇氨酸殘基的這種廣泛的O端糖基化，蛋白分子質(zhì)量的40%～80%由O端相連的糖類組成[12]。本試驗(yàn)通過對黏蛋白cgd5_2060基因克隆表達(dá)后，進(jìn)行細(xì)胞黏附功能的初步研究，為進(jìn)一步揭示其參與微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）入侵宿主細(xì)胞的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

6～8周雌性ICR小鼠購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。微小隱孢子蟲卵囊由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)張龍現(xiàn)教授惠贈，由本實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司，表達(dá)載體pET-32a、大腸埃希菌Escherichia coli TOP10、E.coli Rosetta、Caco2細(xì)胞等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)志物購自美國Thermo Fisher科技公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Millipore公司；抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自美國Sigma公司。

1.2 基因擴(kuò)增和克隆

根據(jù)微小隱孢子蟲cgd5_2060的基因序列（GenBank:XM_626146.1），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物的5'端分別引入Bam HⅠ和SalⅠ的酶切位點(diǎn)，序列如下。F1:5′-CG ggatccATGAAGTTCATAAGATTTGGTTT-3′；R1:5′-GCgtcgacTTATTCAGAATCTTCATCCTGG-3′。設(shè)計(jì)完成后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用TRIzol試劑（購自美國Invitrogen公司）提取微小隱孢子蟲卵囊總RNA后，按照PrimeScript?RT試劑盒（購自日本TaKaRa公司）說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用合成的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照凝膠回收試劑盒（購自美國Axygen公司）說明書進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10中，菌液經(jīng)PCR鑒定后，陽性樣品由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序分析。

1.3 基因的序列比對及生物信息學(xué)分析

用MegAlign軟件將測序反饋的結(jié)果與在GenBank中已登錄的隱孢子蟲cgd5_2060基因序列進(jìn)行比對分析。使用SignalP4.1軟件預(yù)測CGD5_2060蛋白是否具有信號肽，是否為分泌型蛋白。使用PROSITE數(shù)據(jù)庫對CGD5_2060蛋白的功能性基序進(jìn)行預(yù)測，并用軟件DOG 1.0[13]繪制其結(jié)構(gòu)示意圖。

1.4 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對蛋白CGD5_2060進(jìn)行序列分析的結(jié)果表明，其前19個氨基酸為信號肽區(qū)域，為分泌型蛋白。信號肽對其在進(jìn)行原核表達(dá)時會有一定的影響，據(jù)此設(shè)計(jì)去信號肽引物，并在上下游引物的5'端分別引入Bam HⅠ和SalⅠ的酶切位點(diǎn)，序列如下。F2:5′-CGggatccaatggggaaaacAGTATTTCTTT-3′；R2:5′-GCgtcgacTTATTCAGAATCTTCATCCT-3′。設(shè)計(jì)完成后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用上述引物通過PCR擴(kuò)增測序正確的質(zhì)粒，電泳后回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD18-T載體上，隨后轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌TOP10內(nèi)，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測序分析。用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和SalⅠ對測序正確的質(zhì)粒pMD18TS-cgd5_2060和表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切，電泳后分別回收雙酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶連接2種產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta中，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，提取陽性菌的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，測序正確后進(jìn)行保種，將菌命名為pET32a-cgd5_2060-Rosetta。同時，將pET32a空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta中，挑取單菌落，命名為pET32a-Rosetta。

1.5 重組蛋白的表達(dá)和純化

將菌液pET32a-cgd5_2060-Rosetta和pET32a-Rosetta按照1∶100接種于5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、190 r/min培養(yǎng)過夜，然后按照1∶50接種至新鮮的5 mL氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至λ（600 nm）=0.6（約2.5 h），加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG），在37 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，在不同時間點(diǎn)取樣，收集菌體后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析。將蛋白表達(dá)成功的菌液過夜培養(yǎng)后按照1∶50接種至新鮮的300 mL含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、190 r/min搖床培養(yǎng)至λ（600 nm）=0.6（約2.5 h），添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，16℃低溫誘導(dǎo)12 h，菌液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，按照鎳瓊脂糖凝膠FF說明書對表達(dá)的重組蛋白和載體蛋白進(jìn)行純化。

1.6 多克隆抗體的制備

采用SDS-PAGE方法對純化的重組蛋白CGD5_2060進(jìn)行鑒定，用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定重組蛋白的濃度。將純化的重組蛋白CGD5_2060作為抗原免疫6～8周雌性ICR小鼠。首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化（50μg/只），之后的免疫均用弗氏不完全佐劑乳化（25μg/只）。免疫前對每只小鼠采血作為陰性對照，采取皮下多點(diǎn)注射法免疫，首次免疫后14 d進(jìn)行第二次免疫，二免后10 d進(jìn)行第三次免疫，三免后7 d采小鼠尾靜脈血，用間接酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)法檢測其血清抗體的效價，達(dá)到目標(biāo)后即進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血，收集血清。

1.7 重組蛋白的蛋白質(zhì)印跡法鑒定

通過蛋白質(zhì)印跡法對純化的重組蛋白CGD5_2060進(jìn)行分析，一抗為抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶1 000，二抗為HRP-羊抗小鼠IgG，稀釋倍數(shù)為1∶5 000，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence,ECL）進(jìn)行顯色。同時，對制備的鼠抗CGD5_2060血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法鑒定，一抗為1.6節(jié)中收集的血清，稀釋倍數(shù)為1∶2 000。

1.8 重組蛋白與Caco2細(xì)胞黏附特性的檢測

1.8.1 蛋白質(zhì)印跡法檢測

參照文獻(xiàn)[14]中的細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測。即先將Caco2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后吹打分散成單個細(xì)胞，鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密度達(dá)80%～90%后，加入預(yù)熱至37℃的含1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2和2%胎羊血清的1640，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中封閉30 min。用含1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2的1640洗滌2次后，將1 mL稀釋至約200μg/mL的重組蛋白CGD5_2060和載體對照蛋白加入相應(yīng)的孔中，孵育2 h。孵育后用含1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2的1640洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集細(xì)胞制成蛋白樣品，用抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測，觀察蛋白與細(xì)胞的黏附情況。

1.8.2 間接ELISA檢測

參照文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行間接ELISA檢測。即先將Caco2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后吹打分散成單個細(xì)胞，鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用含1%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），每孔50μL，室溫固定30 min。用含5%胎羊血清的PBS，每孔150μL，室溫封閉4 h。將用含1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2和0.1%胎羊血清的PBS稀釋成不同濃度的重組蛋白CGD5_2060，加入至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，每個稀釋倍數(shù)3個重復(fù)，載體對照蛋白作相同處理?？笻is標(biāo)簽鼠源單克隆抗體作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，進(jìn)行間接ELISA測定，檢測蛋白與細(xì)胞的黏附情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增與克隆

以微小隱孢子蟲cDNA為模板，使用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的特異性片段長度為1 854 bp（圖略）。

2.2 序列分析

用MegAlign軟件將測序所得序列與在GenBank中登錄的隱孢子蟲cgd5_2060序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，基因核苷酸序列同源性為99.9%，氨基酸序列同源性為100%。使用SignalP 4.1軟件分析的結(jié)果表明，CGD5_2060的1～19個氨基酸是其信號肽，說明該蛋白是分泌型蛋白。使用PROSITE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)：CGD5_2060含有1個富含蘇氨酸的區(qū)域TTTTTTKSTTTTTTAVTT，位于第510～527個氨基酸處；此外，還有1個與細(xì)胞黏附有關(guān)的序列RGD，位于第69～71個氨基酸處，用DOG 1.0軟件繪制的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域示意圖如圖1所示。

圖1 CGD5_2060蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural schematic diagram of CGD5_2060 protein

2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建分析

對重組克隆質(zhì)粒pMD18TS-cgd5_2060進(jìn)行Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，可見預(yù)期大小的載體條帶和目的基因條帶（圖2A）。將pMD18TS-cgd5_2060雙酶切回收產(chǎn)物與pET32a表達(dá)載體雙酶切回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定（圖2B），重組質(zhì)粒pET32a-cgd5_2060經(jīng)Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切后，可見大小約為1 788 bp的目的條帶及5 900 bp左右的載體條帶（圖2C），與預(yù)期一致。測序后與GenBank公布的序列進(jìn)行比對，氨基酸同源性為100%，表明cgd5_2060基因已成功插入pET32a中，重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及蛋白質(zhì)印跡法分析

2.4.1 重組質(zhì)粒pET32a-cgd5_2060的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有質(zhì)粒pET32a-cgd5_2060和pET32a的Rosetta大腸埃希菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。結(jié)果顯示，在約87和22 kDa處有表達(dá)目的蛋白的趨勢，與理論推算的蛋白產(chǎn)物相對分子質(zhì)量相符（圖3）。隨著誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量升高，且在6 h達(dá)到較高水平。

2.4.2 蛋白純化

蛋白經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)后，于8 000 r/min、4℃下離心5 min，向菌體沉淀中加入50 mmol/L PBS（Na2HPO4·12H2O 1.45 g，NaCl 2.93 g，NaH2PO4·2H2O 0.148 g，加雙蒸水至100 mL，調(diào)節(jié)pH至7.4）充分溶解，經(jīng)超聲波裂解、離心后，按照鎳瓊脂糖凝膠柱說明書進(jìn)行蛋白純化，并對純化后的處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果（圖4）顯示，2種蛋白均可由含250 mmol/L咪唑的PBS洗脫，效果很好。純化后的蛋白經(jīng)透析、超濾濃縮后，測定其重組蛋白CGD5_2060和載體對照蛋白的質(zhì)量濃度分別為1.5和2.1 mg/mL。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid

圖4 蛋白的純化Fig.4 Purification of proteins

2.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

以抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體為一抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測。結(jié)果（圖5）顯示，重組蛋白CGD5_2060和載體對照蛋白均可與His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體特異性結(jié)合，且大小與預(yù)期相符，說明得到的蛋白正確。

2.5 抗體效價的間接ELISA檢測及蛋白質(zhì)印跡法分析

以重組蛋白CGD5_2060作為抗原免疫6～8周雌性ICR小鼠3次后，收集血清，進(jìn)行倍比稀釋，從1∶2 000至1∶2 048 000，并設(shè)置陰性對照和空白對照。間接ELISA檢測結(jié)果顯示，最后所得的血清抗體效價為1∶512 000～1∶1 024 000。將所得的血清與重組蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析，結(jié)果（圖6）顯示，制備的多克隆抗體可以與重組蛋白特異性結(jié)合。

圖5 純化后蛋白的蛋白質(zhì)印跡法分析Fig.5 Western blotting analysisof purified proteins

圖6 小鼠多抗與重組蛋白的蛋白質(zhì)印跡法分析Fig.6 Western blotting analysis of mouse polyclonal antibody against purified proteins

2.6 重組蛋白與Caco2細(xì)胞黏附的檢測結(jié)果

對照蛋白和重組蛋白CGD5_2060與Caco2細(xì)胞孵育后，蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果（圖7）顯示：最后一次洗滌兩者相對應(yīng)的位置均沒有出現(xiàn)條帶，說明最后一次洗滌已經(jīng)將所有未結(jié)合的蛋白全部洗凈；而在最后收集的細(xì)胞裂解液中，重組蛋白CGD5_2060在其相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，且對照蛋白相應(yīng)位置沒有條帶，說明CGD5_2060重組蛋白能黏附Caco2細(xì)胞。將不同濃度稀釋的2種蛋白與Caco2細(xì)胞孵育后進(jìn)行間接ELISA檢測，結(jié)果（圖8）顯示，對照蛋白對Caco2細(xì)胞沒有黏附作用，而重組蛋白可以與Caco2細(xì)胞黏附，其結(jié)合量在一定范圍內(nèi)隨著蛋白濃度的增加而增加，隨后基本趨于穩(wěn)定。

圖7 蛋白質(zhì)印跡法檢測重組蛋白與Caco2細(xì)胞黏附特性的結(jié)果Fig.7 Western blot ting analysis of the recombinant protein CGD5_2060 adhering to Caco2 cells

圖8 間接ELISA檢測重組蛋白與Caco2細(xì)胞黏附特性的結(jié)果Fig.8 Indirect ELISA analysis of the recombinant protein CGD5_2060 adhering to Caco2 cells

3 討論

盡管隱孢子蟲具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，但是很少有探究這種病原體與宿主的相互作用，并且僅很少的寄生蟲抗原被表征。然而，已經(jīng)被充分研究涉及宿主細(xì)胞侵入過程的抗原，均顯示或被預(yù)測具有黏蛋白型O-糖基化。隱孢子蟲基因組含有31個編碼推測為黏蛋白抗原的開放性閱讀框，這進(jìn)一步突出了這類抗原在隱孢子蟲與宿主相互作用中的重要性。迄今為止，被確定在隱孢子蟲黏附和入侵過程中不可或缺的4種抗原都是糖蛋白，包 括 CSL[16]、GP900[17]、GP40/15[18]和 P23[19]。GP900和GP40/15都是黏蛋白樣糖蛋白，而P23預(yù)測含有黏蛋白型O-糖基化位點(diǎn)。

本研究從微小隱孢子蟲cDNA中克隆獲得了1個黏蛋白基因cgd5_2060，并對其蛋白功能相關(guān)基序進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果表明，該蛋白的1～19個氨基酸可能為信號肽，屬于分泌型蛋白。在PROSITE數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)：CGD5_2060蛋白含有1個富含蘇氨酸的區(qū)域TTTTTTKSTTTTTTAVTT，位于510～527個氨基酸處，屬于黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域；此外，還有1個與細(xì)胞黏附有關(guān)的氨基酸序列，由3個氨基酸組成，分別為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），位于69～71個氨基酸處。對CGD5_2060蛋白功能相關(guān)基序的預(yù)測結(jié)果表明，cgd5_2060基因可能與微小隱孢子蟲黏附宿主細(xì)胞相關(guān)。

本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32acgd5_2060，并在大腸埃希菌Rosetta中成功表達(dá)了該重組蛋白，位于菌體超裂后的上清液中。通過鎳柱親和層析法獲得了較高質(zhì)量的重組蛋白CGD5_2060，免疫ICR小鼠獲得了高效價的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究CGD5_2060蛋白在蟲體不同階段中的定位，以及該多抗對蟲體黏附、入侵和增殖的影響提供了材料。

微小隱孢子蟲依賴黏蛋白抗原黏附和入侵宿主細(xì)胞，而Caco2細(xì)胞系是隱孢子蟲研究中常用的細(xì)胞系。本研究將純化的重組蛋白與Caco2細(xì)胞共孵育，通過蛋白質(zhì)印跡法和間接ELISA法檢測了其與宿主細(xì)胞的黏附能力。蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果表明，CGD5_2060重組蛋白可以黏附Caco2細(xì)胞。間接ELISA檢測表明，不同濃度稀釋的重組蛋白與Caco2細(xì)胞孵育后，其結(jié)合量在一定范圍內(nèi)隨著蛋白濃度的增加而增加，隨后基本趨于穩(wěn)定。

本研究初步驗(yàn)證了cgd5_2060是隱孢子蟲感染時重要的黏蛋白基因。后續(xù)利用抗體體外阻斷實(shí)驗(yàn)和建立微小隱孢子蟲cgd5_2060基因敲除株，對于研究該基因在蟲體黏附、入侵過程中發(fā)揮的作用及其介導(dǎo)黏附的機(jī)制，理解隱孢子蟲的生物學(xué)特性及開發(fā)疫苗具有重要意義。

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托架沿Z向運(yùn)動，通過激光跟蹤儀測量定位器1～4的z向移動副上的任一定點(diǎn)的空間位置變化，可求解矩陣T中第8、14、17、20列對應(yīng)的結(jié)構(gòu)誤差；托架繞S1S4旋轉(zhuǎn)，測量定位器2的x向移動副上任一定點(diǎn)的空間位置變化，可以計(jì)算矩陣T中第9列對應(yīng)的結(jié)構(gòu)誤差。

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