梁燕婷，劉云財(cái)，高云，王華兵，徐豫松

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

昆蟲腸道是一個(gè)重要的消化器官，其中棲息著大量的微生物。在長期進(jìn)化過程中，宿主昆蟲與腸道微生物相互合作、相互影響、協(xié)同進(jìn)化，形成了不可分割的共生關(guān)系[1]。昆蟲腸道的微生物群落從簡單到復(fù)雜，對(duì)宿主的營養(yǎng)和消化、病原體的抗性、植物代謝物的解毒以及繁殖等方面起著重要作用[2-3]。正常的腸道菌群甚至被視為一種獨(dú)立的“器官”而增加機(jī)體的適應(yīng)性[4]。腸道細(xì)菌與其宿主之間的關(guān)系可以從共生到致病，從兼性到專性[5-6]。在病原體作用的特定時(shí)間中，腸道細(xì)菌與宿主可以被描述為互惠共生體，但在極端情況下，當(dāng)適合的環(huán)境條件出現(xiàn)時(shí)，共生細(xì)菌可能會(huì)轉(zhuǎn)變成病原體[7]。在正常情況下，不同來源的微生物在昆蟲腸道內(nèi)形成相對(duì)穩(wěn)定的微生物環(huán)境，但當(dāng)微生物群落的組成或位置發(fā)生變動(dòng)時(shí)可能使宿主致病甚至死亡。當(dāng)病原菌入侵昆蟲時(shí)，會(huì)引起系統(tǒng)感染，昆蟲腸道中的有益微生物對(duì)病原菌亦能產(chǎn)生拮抗作用，幫助昆蟲抵御外來病原微生物。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)是分析腸道微生物群落多樣性和鑒定腸道微生物種類最經(jīng)典的方法[8]。常規(guī)的分離培養(yǎng)方法會(huì)對(duì)微生物起篩選作用，其結(jié)果是在特定生境中微生物多樣性可能偏離實(shí)際情況，如一些低豐度的細(xì)菌在合適的條件下迅速生長，并成為優(yōu)勢菌；反之，一些本來高豐度的微生物由于不適應(yīng)人工培養(yǎng)條件而不能被分離鑒定出來。因此，常規(guī)分離鑒定方法不能真正顯示腸道中微生物的多樣性及種群結(jié)構(gòu)。此外，在環(huán)境中約有90%的微生物不能培養(yǎng)[9]，并且菌株培養(yǎng)鑒定過程煩瑣且容易出現(xiàn)偏差。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲的腸道微生物學(xué)研究中。細(xì)菌核糖體16SrDNA基因可變區(qū)是此類生物物種的特征核酸序列，可用來進(jìn)行細(xì)菌的分類鑒定[10]。利用焦磷酸測序技術(shù)檢測細(xì)菌16SrRNA基因序列的方法分析家蠶雌、雄幼蟲中腸內(nèi)微生物的多樣性發(fā)現(xiàn)，雌蠶與雄蠶腸道微生物類群的組成和所占比率存在明顯差異[11]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）和16SrDNA文庫序列分析表明，家蠶（Bombyx mori）幼蟲的腸道細(xì)菌在不同發(fā)育階段存在差異，而腸道特殊菌群的出現(xiàn)與食性有關(guān)，飼料改變會(huì)引起腸道微生態(tài)平衡發(fā)生變化[12]。對(duì)小菜蛾（Plutella xylostella）敏感品系幼蟲中腸微生物16S rRNA基因V6高變區(qū)進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)，中腸細(xì)菌的組成和結(jié)構(gòu)能夠影響其對(duì)農(nóng)藥的抗性[13]。

目前，有關(guān)昆蟲腸道細(xì)菌種群的研究多數(shù)集中在腸道細(xì)菌種群的結(jié)構(gòu)、多樣性和腸道細(xì)菌組成的相互關(guān)系方面，有關(guān)環(huán)境脅迫對(duì)腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響及其協(xié)同作用機(jī)制的研究還較少。桑螟（Glyphodes pyloalis Walker）屬鱗翅目螟蛾科昆蟲，是桑樹的主要害蟲。桑螟通過食用桑葉，使桑葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降，其攜帶的病原可傳播至家蠶而危害蠶桑產(chǎn)業(yè)[14]。桑螟對(duì)高溫高濕的環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，夏秋季高溫多濕環(huán)境易導(dǎo)致桑螟的爆發(fā)。本研究利用16SrDNA高通量測序技術(shù)對(duì)桑螟高溫處理前后腸道菌落的多樣性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，解析不同溫度對(duì)桑螟腸道微生物多樣性變化和菌群結(jié)構(gòu)的影響，為研究逆境昆蟲與腸道微生物的協(xié)同進(jìn)化提供線索，也為從腸道微生物的角度研究害蟲防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及處理

試驗(yàn)材料桑螟幼蟲采自浙江省杭州市浙江大學(xué)紫金港校區(qū)的桑園內(nèi)。收集的桑螟在室溫（25±1）℃、相對(duì)濕度85%、光周期16 h/8 h（晝/夜）條件下用桑葉飼養(yǎng)。選取飼養(yǎng)獲得的桑螟五齡幼蟲作為供試?yán)ハx，分別將其放在25℃和37℃條件下處理12 h。用75%乙醇溶液對(duì)幼蟲體表進(jìn)行消毒，在無菌操作條件下解剖，取出完整腸道，用無菌水緩慢清洗后取其腸道內(nèi)容物，放入滅菌后的2 mL離心管中，-80℃保存，用于DNA提取。每個(gè)樣品取8頭以上桑螟幼蟲，并設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)。樣品分別命名為常溫樣品（CT）和高溫樣品（HT）。

1.2 DNA抽提、擴(kuò)增、純化及測序

按從土壤中提取DNA試劑盒（OMEGA公司，美國）說明書抽提桑螟腸道內(nèi)容物總基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher科技公司，美國）測定DNA濃度。16SrDNA基因V4區(qū)PCR擴(kuò)增體系為：Taq DNA聚合酶25μL，正向和反向引物各2.5μL（10 μmol/L），ddH2O 20μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性50 s；94 ℃變性30 s，58 ℃退火25 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR引物為V4通用引物（上游：5'-AAATTTTTTTTCCCCCCCGG-3'；下游：5'-GGGCCCCCTTTAAAAAAAAAC-3'），擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒[購自生工生物工程（上海）股份有限公司]進(jìn)行純化，并委托華大基因進(jìn)行Illumina測序。

1.3 測序序列分析

將原始數(shù)據(jù)中質(zhì)量較低的序列（reads）濾除，得到較高質(zhì)量的干凈序列（clean reads）；通過序列（reads）之間的重疊區(qū)域?qū)⑵淦唇映深A(yù)聚類后的序列（tags）；在97%相似度條件下將tags聚類形成操作分類單元（operational taxonomic units,OTU），根據(jù)所得OTU與各大數(shù)據(jù)庫比對(duì)，并對(duì)其進(jìn)行注釋；基于注釋結(jié)果對(duì)樣品間微生物結(jié)構(gòu)及不同處理間注釋的差異進(jìn)行分析。去除低質(zhì)量序列（reads）需要符合以下幾點(diǎn)：1）移除最終序列（read）長度低于原始長度75%的序列（reads）；2）去除接頭污染的序列（reads）；3）去除含N的序列（reads）；4）去除低復(fù)雜度的序列（reads）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將相似度大于97%的序列（reads）聚類到1個(gè)OTU中，使用Mothur軟件及貝葉斯分類器，根據(jù)規(guī)范化的核糖體數(shù)據(jù)集將不同OTU的代表序列分類到屬水平上。利用Mothur軟件分析不同樣品的α多樣性，用豐度稀釋曲線評(píng)估物種的豐度。采用艾斯（Ace）指數(shù)、觀察到的物種數(shù)、趙氏（Chao）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)以及辛普森（Simpson）指數(shù)等來評(píng)價(jià)樣品中的物種數(shù)。其中，前面4個(gè)指數(shù)越大，最后1個(gè)指數(shù)越小，說明測得的樣品微生物種類越豐富。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用SPSS19.0軟件繪制樣品中菌屬分布柱形圖。

表1 樣品中微生物豐富度及多樣性指數(shù)Table1 Abundances and diversity indexes of microorganism in two samples

圖1 桑螟腸道細(xì)菌的豐度稀疏曲線（A）及香農(nóng)曲線圖（B）Fig.1 Abundancerarefaction curve(A)and Shannon curve(B)of intestinal bacteriain G.pyloalis

2 結(jié)果與分析

2.1 桑螟腸道菌群結(jié)構(gòu)

利用計(jì)算所得的OTUs、Chao指數(shù)、觀察到的物種數(shù)、Ace指數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來評(píng)價(jià)克隆文庫的大小及內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，結(jié)果如表1所示。從中可知：對(duì)于Chao指數(shù)、觀察到的物種數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)，前面4個(gè)指數(shù)較大，最后1個(gè)指數(shù)較小，說明樣品中的物種比較豐富；且HT的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均大于CT，說明高溫下桑螟腸道菌群豐富度顯著大于正常溫度下的腸道菌群。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，豐度稀疏曲線和Shannon指數(shù)都達(dá)到了平穩(wěn)狀態(tài)，說明微生物多樣性測序深度覆蓋了樣品中大部分微生物。

從圖2中可以看出：在桑螟的腸道菌群門水平上，優(yōu)勢菌門為變形菌門和擬桿菌門；酸桿菌門（Acidobacteria）在高溫處理的樣品中沒有檢測到；而梭桿菌門（Fusobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、軟壁菌門（Tenericutes）為高溫處理后新增的。分析桑螟在正常條件下的優(yōu)勢菌門可以發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）占絕大部分（57.52%），其次為藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）（35.30%），擬桿菌門（Bacteroidetes）（3.55%），厚壁菌門（Firmicutes）（1.80%），放線菌門（Actinobacteria）（1.73%），疣微菌門（Verrucomicrobia）（0.04%），未分類門（0.04%）以及酸桿菌門（0.006 424%）。已有研究表明，鱗翅目昆蟲腸道中的細(xì)菌主要為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門[8]，本試驗(yàn)結(jié)果與其相符。在門水平上比較HT與CT腸道微生物的結(jié)構(gòu)可以說明，這些優(yōu)勢菌門可能在桑螟的生長繁殖及抵御非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

圖2 在門水平上HT與CT腸道微生物的結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Structural comparison of gut microbiota in HTand CTat phylum level

從圖3中可以看出，在屬水平上，CT和HT樣品中優(yōu)勢菌屬所占比例分別為：沃爾巴克菌屬（Wolbachia）占51.16%和77.54%，未分類屬占38.87%和9.55%，節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）占1.54%和0.89%，多形桿狀菌屬（Bacteroides）占1.48%和2.60%，埃希菌屬（Escherichia）占1.31%和0.18%，吉氏副擬桿菌屬（Parabacteroides）占1.40%和0.16%，交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas)占0.91%和 0.53%，葡萄球菌屬（Staphylococcus）占0.56%和0.52%，噬纖維素菌屬（Cellulophaga）占0.19%和0.14%，以及普雷沃菌屬（Prevotella）占0.10%和3.00%。其中，沃爾巴克菌屬和普雷沃菌屬的相對(duì)豐度變化比較大，說明它們對(duì)高溫比較敏感。

2.2 桑螟腸道菌群聚類分析

為了研究高溫對(duì)桑螟腸道優(yōu)勢種群的影響，選取相對(duì)豐度前15的菌屬進(jìn)行聚類分析，比較正常和高溫處理桑螟的腸道菌屬。結(jié)果（圖4）顯示：高溫處理變化最顯著的是假單胞菌屬（Pseudomonas)，其豐度為正常飼養(yǎng)時(shí)的48.74倍；其次為普雷沃菌屬、普拉梭菌屬（Faecalibacterium)和帕拉普菌屬（Paraprevotella），其豐度分別為正常處理的29.24、22.78和6.64倍；多形桿狀菌、沃爾巴克菌在高溫時(shí)的豐度分別為正常狀態(tài)下的1.75倍和1.52倍；節(jié)細(xì)菌屬、噬纖維素菌屬、埃希菌屬、吉氏副擬桿菌屬在高溫處理后豐度下降，分別是對(duì)照的58%、70%、14%和11%。這些結(jié)果表明，高溫抑制了桿菌的繁殖，促進(jìn)了其他菌的繁殖。

圖3 在屬水平上HT與CT腸道微生物的結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Structural comparison of gut microbiota in HTand CTat genuslevel

2.3 桑螟腸道微生物進(jìn)化分析

根據(jù)桑螟腸道中代表性微生物序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)桑螟腸道優(yōu)勢菌群進(jìn)行進(jìn)化分析。從圖5中可以看出，桑螟腸道中的微生物主要分為5大類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ）。Ⅰ類主要由放線菌門組成，分為4個(gè)亞類，分別為Ⅰ-Ⅰ（主要為產(chǎn)氣柯林斯菌屬），Ⅰ-Ⅱ（主要為棒狀桿菌屬），Ⅰ-Ⅲ（主要為丙酸桿菌屬），Ⅰ-Ⅳ（主要為短桿菌屬）。Ⅱ類主要由厚壁菌門組成，分為4個(gè)亞類，分別為Ⅱ-Ⅰ（主要為普拉梭菌屬），Ⅱ-Ⅱ（主要為Dehalobacterium），Ⅱ-Ⅲ（主要為葡萄球菌屬），Ⅱ-Ⅳ（主要為梭狀芽孢桿菌屬）。Ⅲ類主要由變形菌門和擬桿菌門組成，分為4個(gè)亞類，分別為Ⅲ-Ⅰ（主要為沃爾巴克菌屬），Ⅲ-Ⅱ（主要為甲基桿菌屬），Ⅲ-Ⅲ（主要為帕拉普菌屬），Ⅲ-Ⅳ（主要為弓形桿菌屬）。Ⅳ類主要由變形菌門組成，分為2個(gè)亞類，分別為Ⅳ-Ⅰ（主要為寡養(yǎng)單胞菌屬）和Ⅳ-Ⅱ（主要為Massilia）。Ⅴ類主要為Arabidopsis屬。

3 討論

昆蟲在長期進(jìn)化過程中，腸道微生物發(fā)揮著重要作用。昆蟲通常從環(huán)境和食物中獲得各類微生物，經(jīng)過長期進(jìn)化，有些微生物群落經(jīng)過腸道環(huán)境選擇后與昆蟲共生，這些腸道微生物通過參與昆蟲營養(yǎng)、消化和防御從而影響其發(fā)育。當(dāng)昆蟲處在不利于進(jìn)食的環(huán)境中時(shí)，腸道內(nèi)的酶可消化吸收昆蟲腸道微生物中的營養(yǎng)成分，有利于昆蟲的生長發(fā)育。

桑螟作為一種對(duì)蠶桑業(yè)危害嚴(yán)重的害蟲，長期生存在外界環(huán)境中，不斷受到非生物脅迫，經(jīng)過自然選擇，桑螟抗逆性不斷增強(qiáng)，但目前對(duì)于桑螟腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究還比較少。在本研究中，我們利用16SrDNA高通量測序技術(shù)探究了高溫對(duì)桑螟腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，并使用多種方法分析了桑螟腸道菌群的組成變化與高溫脅迫耐受性之間的關(guān)聯(lián)性。

圖4 在屬水平上HT和CT腸道優(yōu)勢菌群的聚類分析Fig.4 Cluster analysisof dominant intestinal florain HTand CTat genuslevel

圖5 桑螟腸道優(yōu)勢菌群進(jìn)化分析Fig.5 Evolutionary analysis of dominant bacterial community in the gut of G.pyloalis

在桑螟腸道中，高溫處理后節(jié)細(xì)菌屬、埃希菌屬、葡萄球菌屬等的豐度明顯降低。節(jié)細(xì)菌屬廣泛分布于環(huán)境中，有的種的桿狀細(xì)胞好氧、不抗酸、不生孢。已有研究表明，節(jié)細(xì)菌屬能夠有效提高對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷的分解能力[15]。埃希菌屬以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)，兼有發(fā)酵和呼吸3種代謝方式。研究表明，埃希菌屬最適生長溫度為37℃，能夠使葡萄糖和其他糖類發(fā)酵并產(chǎn)生丙酮酸，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲酸、乙酸和乳酸，甲酸又會(huì)被分解為等量的二氧化碳和氫氣[16]。而對(duì)于葡萄球菌屬，其中的很多菌種能夠分解麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣[17]。葡萄球菌豐度降低，則桑螟體內(nèi)糖含量增高，機(jī)體滲透壓升高以維持機(jī)體穩(wěn)定。此外，葡萄球菌的致病性菌株能分解甘露醇。桑螟腸道中這些菌屬在高溫時(shí)的比例降低，可能的原因有：1）較高的溫度不適合這些菌生存；2）可能與桑螟在高溫條件下的耐熱性有關(guān)；3）高溫可能通過改變其他菌落使機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變，進(jìn)而導(dǎo)致這些菌的豐度下降。

而在桑螟腸道中，普雷沃菌屬、普拉梭菌屬、帕拉普菌屬、多形桿狀菌屬和沃爾巴克菌屬的豐度都明顯升高。普雷沃菌屬的主要發(fā)酵產(chǎn)物是琥珀酸、少量異丁酸和乙酸，研究認(rèn)為：最適合普雷沃菌生長的溫度是37℃，在20%膽汁酸和6.5%NaCl作用下其生長會(huì)被抑制；普雷沃菌在宿主的代謝過程中發(fā)揮著重要作用，它不能還原硝酸鹽，且利用氨基酸的能力低，會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)鞘脂[18]。對(duì)于普拉梭菌，它能夠通過釋放丁酸和某種尚不明確的物質(zhì)產(chǎn)生抗炎作用，從而糾正腸道菌群失調(diào)[19]。對(duì)沃爾巴克菌的研究結(jié)果顯示，給斯氏按蚊添加沃爾巴克菌，能使斯氏按蚊與沃爾巴克菌形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，從而使這種蚊具有抵抗瘧原蟲的免疫能力，并能將這種免疫能力傳給后代[20]。此外，沃爾巴克菌也可阻止登革熱病毒在蚊子體內(nèi)復(fù)制增殖。因此，推測桑螟腸道中這些菌的豐度升高與桑螟較強(qiáng)的適應(yīng)性有關(guān)；并且可以認(rèn)為，腸道細(xì)菌的差異是在長期進(jìn)化過程中腸道微生物協(xié)同進(jìn)化、生態(tài)適應(yīng)的結(jié)果。

昆蟲腸道微生物豐富多樣，許多菌群與昆蟲長期進(jìn)化維持共生關(guān)系，在昆蟲生命活動(dòng)中起著重要的作用。研究昆蟲腸道微生物有利于全面了解昆蟲的生命活動(dòng)過程，也為基于腸道微生物開發(fā)新的綠色防控技術(shù)奠定基礎(chǔ)。本研究首次利用16S rDNA高通量測序技術(shù)獲得了桑螟腸道微生物相關(guān)信息，分析了桑螟經(jīng)高溫處理后腸道微生物的結(jié)構(gòu)變化與多樣性。但其變化的原因及耐高溫的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究高溫處理試驗(yàn)分析表明，在高溫下，桑螟腸道微生物在多樣性和結(jié)構(gòu)上均有明顯的變化，這些變化的菌落多與消化吸收及免疫防御相關(guān)。在正常條件下，桑螟腸道的優(yōu)勢菌落在門水平上為變形菌門和藍(lán)藻菌門；高溫處理后，優(yōu)勢菌群為變形菌門，其次則為擬桿菌門，沒有檢測到酸桿菌門，但新增了梭桿菌門、浮霉菌門和軟壁菌門。從屬的水平上分析，在正常溫度下，優(yōu)勢菌群為沃爾巴克菌屬、節(jié)細(xì)菌屬和多形桿狀菌屬；高溫處理后則為沃爾巴克菌屬和普雷沃菌屬。在豐度上，高溫處理后假單胞菌屬的變化最顯著，為正常飼養(yǎng)時(shí)豐度的48.7倍，其次為普雷沃菌屬。這些變化在一定程度上增加了桑螟的抗逆性，使其更好地適應(yīng)高溫環(huán)境。

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