陳功文，溫政勝，秦瑤，許瑛瑛，胡福良，鄭火青

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

人類所需食物的三分之一依賴于昆蟲授粉[1]，每年僅通過昆蟲授粉就可使美國的種植業(yè)增值超過150億美元[2]。以蜜蜂為主的授粉昆蟲數(shù)量不足不僅會影響農作物授粉，對糧食安全產生威脅，還會對植物多樣性及生態(tài)平衡帶來不利影響[3]。西方蜜蜂（Apis mellifera）是世界養(yǎng)蜂業(yè)使用的主要蜂種，近年來全球范圍的蜂群損失現(xiàn)象嚴重。由于在越冬期間蜂群面臨更大的環(huán)境壓力，而且蜂群內個體停止更新?lián)Q代，因此越冬期是蜂群損失的高發(fā)期。據報道，西方蜜蜂蜂群越冬期損失率在美國、歐洲和非洲分別達到22.5%～35.8%[4]、7%～30%[5]和 29.6%[6]。雖然 LIU 等[7]對2010—2013年我國12個主要西方蜜蜂飼養(yǎng)省份蜂群越冬損失情況的調查中，我國西方蜜蜂蜂群越冬期間平均損失率僅為8.9%，但近年來在江浙地區(qū)出現(xiàn)的大面積越冬蜂死亡現(xiàn)象引起了業(yè)界的普遍擔憂[8-9]。

病原菌、寄生蟲、飼養(yǎng)條件和環(huán)境條件是影響蜜蜂健康的主要因素。近年來，蜜蜂病毒流行率很高，大量的流行病學研究都表明病毒感染在越冬蜂群損失中扮演著重要角色[10-12]。目前，已在蜂群中發(fā)現(xiàn)24種病毒[13-14]，其中最為常見的7種病毒包括：蜜蜂急性麻痹病毒（Acute bee paralysis virus,ABPV）、黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus,BQCV）、慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic bee paralysis virus,CBPV）、殘翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、以色列蜜蜂麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus,IAPV）、克什米爾病毒（Kashmir bee virus,KBV）和囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus,SBV）。ABPV、IAPV和KBV是3種同源性較高的急性病毒，感染蜜蜂后會引起病蜂身體顫抖，逐漸麻痹，導致急性死亡[15]。在美國和德國，至少分別有2項長期的研究有力地證明了IAPV和ABPV與冬季蜂群損失間有緊密聯(lián)系[10,16]。DWV的毒力相對較低，但由于流行率非常高，且與狄斯瓦螨（Varroa destructor）存在很強的協(xié)同作用，被認為是導致全球范圍內蜂群損失的主要因子之一[17]。BQCV主要對蜂王的幼蟲和蛹產生危害，常以隱性感染的方式長期存在于蜂群中，對蜂群的危害較小[18-19]；SBV主要感染東方蜜蜂，對西方蜜蜂危害較低；KBV則尚未在我國蜂群中檢出。

本研究通過跟蹤浙江省3個蜂場48群意大利蜜蜂（西方蜜蜂的主要亞種，Apismellifera ligustica）在越冬前后蜂群病毒感染情況及蜂群越冬表現(xiàn)，分析越冬期蜜蜂病毒感染變化規(guī)律，探析影響越冬期蜜蜂健康的病毒種類，為防控蜜蜂病毒病、減少越冬期蜜蜂死亡提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

在2016年12月—2017年1月蜂群越冬期間，對浙江省金華市2個蜂場（JH1、JH2）各20個蜂群，以及浙江大學實驗蜂場（ZJU）8個蜂群進行越冬前和越冬后取樣，并記錄所有蜂群越冬期間的健康情況。ZJU的8個蜂群在越冬期間每隔1周連續(xù)取樣3次（總共取樣5次）。每群蜜蜂每次取樣超過50只，對所取樣本檢測 ABPV、BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV等6種常見蜜蜂病毒的感染情況，并對感染率較高的病毒進行基因組拷貝數(shù)定量。

1.2 主要試劑和儀器

RNApure超純總RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）、FSQ-201反轉錄試劑盒（ToYoBo公司，日本）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）試劑盒（GenStar2×Taq PCR StarMix）、QPS-201熒光定量PCR試劑盒（ToYoBo公司，日本）、瓊脂糖[生工生物工程（上海）股份有限公司]、DNA標志物（TaKaRa公司，日本）、PCR儀（ABI公司，美國）、NanoDrop 2000分光光度計（賽默飛世爾科技公司）、StepOnePlus熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）等。

1.3 RNA提取

將25只蜜蜂放入研缽，加入液氮研磨至粉末，取粉末約170 mg于1.5 mL離心管中，同時加入1 mL RNA裂解液，充分振蕩15 s后放置15 min，使核蛋白體完全裂解。參照RNApure超純總RNA快速提取試劑盒的操作說明提取蜜蜂RNA。用NanoDrop 2000測定所提RNA的濃度。

1.4 反轉錄反應

取800 ng RNA于200μL離心管中，65℃孵育5 min，置于冰上快速冷卻。在上述離心管中加入5×RTMaster Mix 4μL，用無核酸酶水加至反應總體積為20μL。

將上述反應液振蕩離心后，按37℃、15 min，50 ℃、5 min，98℃、5 min進行反應，然后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 6種常見蜜蜂病毒定性檢測

配置20μL PCR反應體系，其中2×Taq PCR StarMix 10μL，cDNA 2μL，上下游引物各1μL，無核酸酶水6μL。擴增程序為：94℃，2 min；94℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，30 min）中檢測。引物序列見表1。

表1 定性檢測6種常見蜜蜂病毒的引物序列Table1 Sequences of primersused for qualitative detection of six common bee viruses

1.6 病毒絕對定量

通過普通PCR確定感染率最高的3種病毒分別為DWV、BQCV和IAPV。由于BQCV主要對蜂王蛹產生危害，對工蜂和蜂群危害較小[20]，因此，本試驗不對其進行拷貝數(shù)分析。試驗制備DWV和IAPV的PCR產物標準質粒溶液，用NanoDrop 2000測得其質量濃度分別為95.2和249.8 ng/μL?？截悢?shù)的計算公式為：拷貝數(shù)/μL-1=6.02×1023×[質粒質量濃度/(ng/μL)×10-9]/（DNA長度×660）。其中，DNA長度為所使用質粒的堿基數(shù)和質粒所連接片段的堿基數(shù)之和。計算得知，二者拷貝數(shù)分別為3.06×1010和7.94×1010μL-1。

以質粒標準品為模板，按10倍梯度依次稀釋6個不同的濃度，并以不同濃度的質粒溶液為模板進行熒光定量PCR。反應體系（10μL）為：模板1μL，上游和下游引物共1μL，Mix酶5μL，純水3μL。熒光定量PCR擴增程序為：95 ℃，1 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，共40個循環(huán)。溶解曲線分析溫度程序為：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。其中60℃至95℃反應總時間為20 min。DWV定量PCR引物序列為：上游引物5'-CGTGGTGTAG TAAGCGTCGT-3'；下 游 引 物 5'-TCATCCGTAG AAAGCCGAGT-3'。IAPV定量PCR引物序列為：上游引物 5'-TCGCTGAAGGCATGTATTTC-3'；下游引物5'-ATTACCACTGCTCCGACACA-3'。

對病毒質粒進行梯度熒光定量PCR試驗后，根據不同濃度對應的CT值建立2種病毒的標準曲線：yDWV=-3.321 3x+40.914，R2=0.999 7；yIAPV=-3.264 6x+38.918，R2=0.995 5（y代表CT值，x代表病毒基因組拷貝數(shù)的常用對數(shù)，病毒基因組拷貝數(shù)為10x）。

2 結果與分析

2.1 蜂群越冬表現(xiàn)

越冬期間JH1和JH2蜂場均未發(fā)現(xiàn)蜂群死亡，所有蜂群越冬情況良好。而在ZJU蜂場的8個蜂群中，有1個蜂群在越冬期間死亡，另有4個蜂群在越冬后（1月初）瀕臨死亡，箱內只剩少許工蜂。

2.2 蜂群病毒感染情況

由圖1可知，3個蜂場48群蜜蜂均未感染ABPV、CBPV和SBV，而BQCV、DWV和IAPV感染率較高。JH1蜂場蜂群越冬前和越冬后的病毒感染率均依次為BQCV=DWV＞IAPV，其中，BQCV和DWV感染率在越冬前達到95%，越冬后達到100%。JH2蜂場蜂群越冬前僅感染BQCV和DWV，感染率分別為100%和40%；越冬后有2群（10%）出現(xiàn)IAPV感染。ZJU蜂場蜂群越冬前病毒感染率依次為DWV=IAPV＞BQCV，其中DWV和IAPV感染率均達到100%；越冬后病毒感染率依次為IAPV＞DWV＞BQCV。

圖1 JH1、JH2和ZJU蜂場蜂群越冬前和越冬后病毒感染率Fig.1 Infection ratesof virusesin honey beecoloniesin apiaries JH1,JH2 and ZJU before and after overwintering

2.3 蜂群越冬前和越冬后DWV和IAPV病毒量比較

從圖2A中可以看出，JH1蜂場蜂群的DWV和IAPV的病毒基因組拷貝數(shù)都相對較高，越冬前DWV基因組拷貝數(shù)達到1×107左右，IAPV基因組拷貝數(shù)達到1×106左右，蜂群越冬后DWV和IAPV基因組拷貝數(shù)都有顯著升高（P＜0.05）。從圖2B中可以看出，JH2蜂場蜂群的病毒基因組拷貝數(shù)在越冬前和越冬后都相對較低，越冬前DWV基因組拷貝數(shù)只有1×104左右，IAPV基因組拷貝數(shù)只有1×102左右，越冬后DWV基因組拷貝數(shù)顯著上升（P＜0.05），但IAPV基因組拷貝數(shù)無顯著變化（P＜0.05）。從圖2C中可以看出，ZJU蜂場蜂群的這2種病毒量也都相對較高，其中DWV基因組拷貝數(shù)均值接近1×108，越冬后IAPV基因組拷貝數(shù)有上升趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），可能是因為樣本量偏少。

比較ZJU蜂場越冬后瀕臨死亡蜂群和正常蜂群的病毒基因組拷貝數(shù)，結果（圖3A）發(fā)現(xiàn)，瀕臨死亡蜂群的IAPV極顯著增高（P＜0.01），其基因組拷貝數(shù)均值達到了1×109以上。比較越冬過程中或越冬后死亡的5個蜂群和越冬后仍健康存活的3個蜂群在越冬前的病毒滴度，發(fā)現(xiàn)前者IAPV基因組拷貝數(shù)的平均值更高，但兩者差異不顯著（圖3B）。

圖2 3個蜂場蜂群在越冬前和越冬后DWV和IAPV病毒基因組拷貝數(shù)比較Fig.2 Genomecopy numbers of DWV and IAPV in honey bee colonies before and after overwintering in three apiaries

圖3 ZJU蜂場死亡蜂群與健康蜂群病毒基因組拷貝數(shù)比較Fig.3 Genome copy numbers of viruses in died colonies and healthy colonies in apiary ZJU

2.4 ZJU蜂場蜂群在越冬過程中DWV和IAPV病毒量的變化趨勢

對ZJU蜂場8個蜂群越冬期5個時間點的分析結果（圖4）表明，在越冬過程中，DWV基因組拷貝數(shù)逐漸降低，而IAPV基因組拷貝數(shù)呈上升趨勢。

圖4 ZJU蜂場蜂群越冬期5個時間點的DWV和IAPV病毒基因組拷貝數(shù)變化趨勢Fig.4 Genome copy number changes of DWV and IAPV in honey bee colonies from apiary ZJU under five time pointsduring overwintering period

3 討論

AI等[26]檢測了我國18個省份170個西方蜜蜂樣本，除KBV未檢測到外，DWV、BQCV、SBV、IAPV、ABPV和CBPV都有檢測到，以蜂場為單位，感染率分別為94%、44%、21%、18%、6%和9%，在浙江的4個蜂場也未檢測到ABPV、CBPV和KBV。在YA?EZ等[27]的研究中，以蜂場為單位，DWV、IAPV、BQCV和SBV感染率分別為80%、40%、20%和10%。在本研究的3個蜂場中都未檢測到的病毒為ABPV、CBPV和SBV，這和上述2項研究中關于這3種病毒在西方蜜蜂上的感染率很低的結論一致。DWV、BQCV和IAPV在3個蜂場中都有檢測到，而且這3種病毒都有在某個蜂場某一時間點蜂群感染率達到100%的情況。說明對于越冬意蜂群，這3種病毒是感染率最高的病毒。

本研究所涉及的3個蜂場可以作為3個類型蜂場的典型代表。JH2蜂場蜂群病毒感染率較低，病毒基因組拷貝數(shù)也低，健康程度較高。JH1蜂場病毒感染率較高，但在越冬前以毒力較低的BQCV和DWV為主，越冬后DWV和IAPV病毒基因組拷貝數(shù)都顯著上升。盡管該蜂場蜂群越冬期未出現(xiàn)死亡，但這些蜂群的健康狀況堪憂。ZJU蜂場蜂群越冬前BQCV、DWV和IAPV的感染率都很高，從病毒感染情況看，屬于健康狀態(tài)較差的蜂群。這一蜂場出現(xiàn)較高比例（5/8）的越冬蜂群損失，說明整體上病毒感染情況與蜂群越冬期健康有關。

在ZJU蜂場，與越冬后仍健康存活的3個蜂群相比，越冬后取樣時瀕臨死亡蜂群的IAPV基因組拷貝數(shù)極顯著提高，均值達到1×109以上，且這些蜂群在越冬前IAPV基因組拷貝數(shù)也有更高的趨勢，達到1×107左右，說明IAPV的高滴度感染與越冬蜂群的死亡有密切關系。在越冬過程中，DWV病毒量呈下降趨勢，而IAPV病毒量呈明顯上升趨勢，進一步說明IAPV是影響越冬蜂健康的重要因素。本研究結果也提示，IAPV感染水平可以作為預測蜂群越冬表現(xiàn)的指標。但由于在本研究中ZJU蜂場樣本量較少，因此仍有待進一步研究。

JH1蜂場蜂群越冬后DWV和IAPV病毒量都顯著上升，JH2蜂場蜂群越冬后只有DWV病毒量顯著上升，而ZJU蜂場蜂群DWV病毒量呈下降趨勢，IAPV病毒量呈上升趨勢。2種病毒的病毒量在不同蜂場蜂群越冬期間的變化規(guī)律不同，說明這2種病毒量的變化和蜂群自身條件存在密切關系，且可能和蜂群越冬表現(xiàn)有關。

蜜蜂病毒的混合感染非常普遍[28]，不同病毒間可能存在一定的互作關系。ANDERSON等[29-30]認為，激活KBV可以抑制SBV和BQCV的復制，且KBV與ABPV可能存在競爭關系。IAPV與DWV在某些特定條件下（如ZJU蜂場蜂群健康狀態(tài)較差時）是否存在競爭抑制關系也值得進一步研究。

綜上表明，IAPV是影響越冬期意蜂健康的重要因素。因此，如何降低IAPV感染水平及提高蜜蜂抗IAPV能力是減少蜜蜂越冬期損失所需面對的重要問題。

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