張冬生，劉 宗，宋 莉*，趙德剛，2*

(1. 貴州大學 生命科學學院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院， 貴州 貴陽 550006 )

釀酒酵母中豐富的營養(yǎng)及活性物質(zhì)，在改善動物胃腸道及免疫功能[1-2]、提升產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮著重要的作用，故被廣泛應用于醫(yī)療保健、飼料添加劑及食品生產(chǎn)等領(lǐng)域[3-4]。但在儲存及制備過程中如何保持酵母的生物活性是限制其利用的關(guān)鍵因素，也是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標。而固態(tài)微生物制劑具有保藏期長、不易污染、便于運輸貯藏和質(zhì)量易控等優(yōu)點[5，6]，因此廣泛應用于微生物儲存及保藏。生產(chǎn)中常采用真空冷凍干燥技術(shù)制備固態(tài)微生物制劑，但冷凍干燥過程中易結(jié)冰引起溶質(zhì)變化及冰晶的形成，導致細胞結(jié)構(gòu)[7，8]和酶分子鈍化，導致細胞死亡[9]，影響細胞活力降低對產(chǎn)品的有效利用率。而凍干保護劑的使用可以有效的降低對細胞損傷，保持微生物原有各種理化特性[10，11]和生物活性，減少加工過程對細胞損傷。

故本文采用析因設(shè)計實驗與響應面優(yōu)化分析相結(jié)合的方法[12]，對實驗室創(chuàng)制出具有抗病毒特性雞干擾素(ChIFN)重組釀酒酵母工程菌的真空冷凍干燥保護劑進行篩選和優(yōu)化，以期為該工程菌的應用和生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1工程菌株 表達雞干擾素的釀酒酵母工程菌株(ChIFN)由貴州大學山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室創(chuàng)制。

1.1.2主要試劑及設(shè)備 酵母抽提物和蛋白胨均購自O(shè)XOID(英國)；半乳糖、乳糖、蔗糖 、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、半胱氨酸鹽、β-環(huán)狀糊精和脫脂奶粉等均購自北京索萊寶公司(北京)，Ura Minus Media購自北京范基諾科技有限公司(北京)；真空冷凍干燥機(FreeZone?4.5 Liter Freeze Dry Systems)為Labconco公司(美國)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1工程菌冷凍干燥及菌粉質(zhì)量檢測 將SC培養(yǎng)基中的工程菌誘導培養(yǎng)至穩(wěn)定期，以4℃、5000 r/min離心10 min收集菌泥，按體積比1∶1的比例加入凍干保護劑并混合均勻，平鋪于滅菌平皿中置于真空冷凍干燥機-80℃、真空度3～10 Pa條件下干燥8 h至含水量降至6%以下。采用次甲基藍染色法[13]與血球計數(shù)法[14]對凍干菌粉質(zhì)量進行分析，統(tǒng)計復水活菌數(shù)，按細胞存活率(%)=活細胞個數(shù)/(活細胞個數(shù)+死細胞個數(shù))×100計算細胞存活率。

1.2.2單一凍干保護劑篩選 參考相關(guān)文獻[15]選擇和配制蔗糖、乳糖、海藻糖、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、硫酸錳、半胱氨酸鹽、脫脂奶粉、明膠、β-環(huán)狀糊精和吐溫-80等13種保護劑，以無菌水作為對照，制備凍干粉并測定菌粉活力，每組實驗重復3次。

1.2.3響應面試驗設(shè)計與析因設(shè)計試驗篩選復合保護劑 通過析因設(shè)計試驗[16]篩選冷凍干燥過程中保護效果良好的保護劑。結(jié)合中心組合設(shè)計(Central-Composite Design，CCD)試驗[17]進行二階響應面模型擬合，以凍干工程菌存活率為響應值，預測最優(yōu)復合保護劑配方并進行試驗驗證，以確定最佳復合保護劑配方。每組實驗進行3個重復。使用Design Expert 8.0.5.0軟件(Stat-Ease Inc.， Minmeapolis，USA)[18，19]進行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護劑對工程菌存活率的影響

圖1 單一保護劑對工程菌存活率的影響Fig.1 Protective effects of different cryoprotectants on the recombinant yeast

單一保護劑對細胞存活率的影響結(jié)果表明(圖1)，脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、聚乙二醇的濃度為10 g/100mL、15 g/100mL、5 g/100mL、10 g/100mL、5 g/100mL、1 g/100mL，其對工程菌的保護效率分別為43.73%、37.78%、30.60%、29.25%、28.94%、28.45%。脫脂奶粉、蔗糖和海藻糖對工程菌的保護率均大于30%，而乳糖、甘油和聚乙二醇的保護率在25%～30%之間，其中七種單一保護劑的保護效率低于20%。

2.2 二水平析因試驗設(shè)計及其結(jié)果

根據(jù)二水平析因設(shè)計(表1)，分析得到真空冷凍干燥過程中影響細胞存活率的主要保護劑及各保護劑之間的交互作用。結(jié)果表明(表2)，不同保護劑對菌粉的保護效果存在一定差異，7種保護劑中脫脂奶粉、蔗糖和聚乙二醇對工程菌的保護作用最大，其影響力為脫脂奶粉>聚乙二醇>蔗糖>蔗糖>甘油>甘露醇>明膠>β-環(huán)糊精，但甘露醇、明膠及β-環(huán)狀糊精的影響系數(shù)均為負值，對細胞的冷凍干燥過程起到阻礙作用，因此可以去除這3種保護劑。為了降低凍干保護劑的成本選擇脫脂奶粉、聚乙二醇和蔗糖3種保護劑為凍干過程的主要影響因子即主效應，進一步對3種保護劑的最佳配比進行優(yōu)化。

表1 二水平析因試驗設(shè)計及響應值Tab.1 Two - level factorial design and response value

表2 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Tab.2 Partial regression coefficients and analyses of their significances

2.3 響應面設(shè)計試驗優(yōu)化復合保護劑配方

通過對蔗糖、脫脂奶粉、聚乙二醇三種組分進行中心組合設(shè)計(表3)，得到相應的二次回歸方程模型：Y=79.50-3.27×A+0.51×B+2.72×C-0.43×A×B-1.79×A×C-1.15×B×C-9.71×A2-7.05×B2-7.13×C2(R2=0.9805) 式中Y為響應值，及冷凍干燥后細胞存活率；A、B、C分別是蔗糖、脫脂奶粉和聚乙二醇濃度(g/ml)。式中多元相關(guān)系數(shù)R2=0.98，說明該模型對實際擬合度好；Prob(p)> F 值 小于0.0001(Prob(p)> F < 0.05 視為模型顯著)，可用于響應值預測。

為了獲得最佳的復合保護劑配比，因此建立理想數(shù)學模型進行保護劑分配及濃度優(yōu)化。在中心組合設(shè)計基礎(chǔ)上，進一步根據(jù)二次模型回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗，結(jié)果表明(表5)，A和C因素對細胞成活率的線性效應顯著，B因素不顯著。因此在本試驗設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，蔗糖與脫脂奶粉、蔗糖與聚乙二醇及脫脂奶粉與聚乙二醇的交互作用顯著(Prob(P)>F <0.0001)，說明凍干保護劑兩兩之間的交互作用對工程菌在真空冷凍干燥過程具有顯著的保護效果。

表3 中心組合設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Center combination design and results

表4 中心組合設(shè)計二次模型方差分析Tab.4 Center Combinatorial Design Quadratic Model Variance Analysis

表5 二次模型回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗Tab.5 Quadratic model regression equation coefficient and significance test

A、B：蔗糖和脫脂奶粉；C、D：蔗糖和聚乙二醇；E、F：脫脂奶粉和聚乙二醇

根據(jù)回歸方程繪制影響因素兩兩交互作用的等高線及三維曲面圖表明(圖2)，曲線拋物面存在極大值，脫脂奶粉、蔗糖、聚乙二醇三個因素之間的交互作用明顯，確定保護劑最佳水平范圍。分析優(yōu)化得到最佳的復合保護的配方，當蔗糖、脫脂奶粉和聚乙二醇配比分別為14.44 g/100mL、10.08 g/100mL和1.11 g/100mL時，工程菌實際存活率達到80.81%，接近79.50%(表3)的預測值。

3 結(jié)論與討論

真空冷凍干燥技術(shù)在提升產(chǎn)品品質(zhì)[20]、延長儲存時間[21]和增加產(chǎn)品的活性等方面發(fā)揮著重要作用[22]，因此該技術(shù)得到廣泛的運用。但冷凍過程冰晶極易造成細胞損傷，所以在該過程中引入不同種類的單一保護劑組成復合保護劑可以對工程菌起到有效保護作用，能明顯的改善產(chǎn)品質(zhì)量。

本試驗選取13種凍干保護劑作為研究對象，單因素試驗研究表明脫脂奶粉的保護效果最好(43.73%)，但仍難滿足高質(zhì)量標準菌粉的生產(chǎn)及應用要求。因此進一步通過二水平析因設(shè)計試驗篩選13種凍干保護劑中影響細胞存活的主效應，并結(jié)合響應面設(shè)計試驗優(yōu)化得到最佳復合保護劑配方。研究發(fā)現(xiàn)脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油和聚乙二醇在作為單一保護劑時，對酵母細胞具有較好的保護效果[23]。其中脫脂奶粉、蔗糖和聚乙二醇3種凍干保護劑在凍干過程中的貢獻作用最大，是組成的較為理想復合保護劑配方。剩余10種單一保護劑的保護效果較差，可能與保護劑的作用方式不同密切相關(guān)[24]，蔗糖與脫脂奶粉作為非滲透性保護劑，聚乙二醇作為滲透性保護劑，兩種類型的保護劑相結(jié)合能實現(xiàn)互補，提高對酵母的保護作用，保證較高的細胞存活率。優(yōu)化得到蔗糖、脫脂奶粉和聚乙二醇不同配比組成的復合保護劑保護率可達80.81%，說明該保護劑具有較好的保護效果。該復合保護劑具有組成簡單、成本較低、操作簡便等[25]優(yōu)勢，因此該研究為釀酒酵母在其他方面的應用提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

蔗糖、脫脂奶粉和聚乙二醇這三種保護劑的保護作用較為突出，能顯著提高工程菌在-80℃、3～10 Pa真空度、干燥8 h、菌體含水量降至5.63%環(huán)境下的耐受能力，降低對細胞的損傷。優(yōu)化得到保護劑配方為蔗糖14.44 g/100mL、脫脂奶粉10.08 g/100mL、聚乙二醇1.11 g/100mL。

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