熊 偉，王 雪，秦國(guó)兵，姚俊杰 ，2*，唐 鑫

(1. 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

菲牛蛭 (PoecilobdellamanillensisLesson)是吸血類(lèi)水蛭的一種，俗名金邊螞蟥、馬尼拉醫(yī)蛭，隸屬于無(wú)吻蛭目(Arhynchobdellida)醫(yī)蛭(Hirudinidae)牛蛭屬(PoecilobdellaWhitman)。由菲牛蛭唾液腺分泌的水蛭素是治療心腦血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病的重要藥物[1-3]。但過(guò)度的捕撈及生態(tài)環(huán)境惡化等諸多原因的影響，導(dǎo)致菲牛蛭資源急劇下降。因此，人們?cè)谔骄糠婆ｒ稳斯ゐB(yǎng)殖方法，其中用配合飼料養(yǎng)殖也是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，人們從菲牛蛭攝食與生長(zhǎng)、養(yǎng)殖方式、病害防治、繁殖[4-7]等方面做了很多工作，菲牛蛭的人工繁殖也取得成功。但是菲牛蛭還是采用粗放式的血液投喂，而血液的成本高、不易獲得、易腐敗、易污染、質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，限制了菲牛蛭的規(guī)?；B(yǎng)殖。因此，研究菲牛蛭的人工配合飼料是急待解決的問(wèn)題。2013年李軍[8]報(bào)道了菲牛蛭基礎(chǔ)飼料配方，并從生長(zhǎng)及成活率兩個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，其配方中蛋白含量是55%，而本實(shí)驗(yàn)室研究小組提高飼料蛋白含量72%以上，更能滿(mǎn)足菲牛蛭的生長(zhǎng)。所以，本研究采用雞血和自制配合飼料對(duì)菲牛蛭進(jìn)行飼養(yǎng)，從水蛭素活性和抗氧化兩個(gè)方面對(duì)配合飼料做出評(píng)價(jià)，以期為規(guī)?；B(yǎng)殖菲牛蛭提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菲牛蛭購(gòu)買(mǎi)于貴州蛭臻寶生物科技有限公司。隨機(jī)挑選大小均勻、體格健壯且體表無(wú)病，平均體重為(2.83±0.71)g，平均體長(zhǎng)(5.33±0.54)cm的菲牛蛭幼苗。配合飼料主要成分為血球蛋白(NP-90)、血漿蛋白(NP-2002)、氯化鈉、L-精氨酸、維生素C(Vc)；血液采用菜市場(chǎng)收集的雞血(不加鹽、不加水)。實(shí)驗(yàn)用水采用花溪河河水，pH7.5～7.8，水溫20～26℃，溶解氧6～9 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)組，配合飼料組和血液組，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)養(yǎng)殖箱規(guī)格為35 cm×25 cm×20 cm，養(yǎng)殖密度為40尾/箱。實(shí)驗(yàn)組采用自制配合飼料灌入風(fēng)干豬血腸衣中投喂，對(duì)照組采用雞血打成血漿灌入風(fēng)干豬血腸衣中投喂，養(yǎng)殖周期60 d，投喂頻率為3 d/次，每天換水量50%，停食1周采樣。

1.3 樣品制備

樣品采集：每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取28尾水蛭，3尾直接放入-80℃冰箱凍存，用于水蛭素活性測(cè)定。剩余25尾置于冰上解剖取腸道及嗉囊組織，取樣菲牛蛭結(jié)構(gòu)圖參照文獻(xiàn)[9](取樣編號(hào)：配合飼料組，嗉囊記為“ss”，腸道記為“sc”；血液組，嗉囊記為“xs”，腸道記為“xc”)。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測(cè)定

組織蛋白(考馬斯亮藍(lán)、超氧化物歧化酶SOD(羥胺法)、過(guò)氧化氫酶CAT(可見(jiàn)光法)、丙二醛MDA(TBA法)，實(shí)驗(yàn)用試劑盒均購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究院。水蛭素活性測(cè)定采用《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定的測(cè)定方法及文獻(xiàn)[10]提供的方法。在數(shù)據(jù)體現(xiàn)時(shí)，在相應(yīng)標(biāo)號(hào)前增加指標(biāo)英文縮寫(xiě)，如“SODss”代表配合飼料組嗉囊組織中超氧化物歧化酶的活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)(n=3)表示。運(yùn)用LSD和Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。p<0.05認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 配合飼料基礎(chǔ)配方對(duì)比及營(yíng)養(yǎng)組成

配合飼料配方主要原料組成見(jiàn)表1，血球蛋白(NP-90)比例4%，血漿蛋白(NP-2002)比例為5%，氯化鈉為2 g、L-精氨酸為0.17 5g、VC為0.2 g。加入純凈水到1000 ml，灌腸投喂。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成Tab.1 Composition of the experimental diets

2.2 配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭水蛭素活性的影響

配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭水蛭活性影響見(jiàn)表1，血液組水蛭素活力為(76.172±0.391)U/g，配合飼料組水蛭素活力為(75.391±0.392)U/g。配合飼料組略低于血液組水蛭素活性，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，差異性不顯著(P>0.05)。

表2 配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭水蛭素活性的影響(U/g)Tab.2 The effect of compound feed and blood feed on the activities of hirudin in Poecilobdella manillensis

表2 配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭水蛭素活性的影響(U/g)Tab.2 The effect of compound feed and blood feed on the activities of hirudin in Poecilobdella manillensis

餌料種類(lèi)配合飼料血液水蛭素活性75.391±0.392a76.172±0.391a

注：不同字母表示測(cè)定數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭抗氧化指標(biāo)的影響

配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭超氧化物歧化酶(SOD)的影響見(jiàn)圖1，配合飼料組腸道與血液組腸道SOD活力分別為(238.195±22.607)與(172.620±26.284) U/mgprot，差異顯著(P<0.05)；而配合飼料組嗉囊SOD顯著低于血液組嗉囊(P<0.05)，SOD值分別為(23.171±3.741)和(138.724±20.841) U/mgprot(P<0.05)。

注： 不同字母表示測(cè)定數(shù)據(jù)存在顯著性差異( P <0.05)

配合飼料與血液對(duì)菲牛蛭丙二醛(MDA)的影響如圖2所示，配合飼料組嗉囊組織MDA含量顯著低于血液組(P<0.05)，含量分別為(25.101±1.034)和(89.602±13.874)nmol/mgprot；配合飼料組腸道MDA含量稍低于血液組腸道，差異不顯著(P>0.05)，含量分別為(8.088±0.531)和(10.697±0.721)nmol/mgprot。

配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭過(guò)氧化氫酶(CAT)活力影響見(jiàn)圖3，在腸道組織中，配合飼料組CAT顯著高于血液組(P<0.05)，CAT活力分別為(36.157±5.966)和(22.326±1.329)nmol/mgprot；而在嗉囊組織中，配合飼料組略低于血液組，活力分別為(1.399±0.161)和(2.161±0.014)nmol/mgprot，差異不顯著(P>0.05)。

注： 不同字母表示測(cè)定數(shù)據(jù)存在顯著性差異( P<0.05)

注： 不同字母表示測(cè)定數(shù)據(jù)存在顯著性差異( P<0.05)

3 結(jié)論與討論

3.1 NP-90、NP-2002比例分析

菲牛蛭配合飼料的研究處于起步階段，目前為止NP-90、NP-2002是菲牛蛭配合飼料主要蛋白來(lái)源。李軍[8]報(bào)道了NP-90比例為0.5%，NP-2002比例為3%，補(bǔ)齊其他成分，加入純水后2 L，干飼料中蛋白含量為55%，含水量為95.6%，個(gè)體增重率達(dá)19.91%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血液組的184.24%。這可能與蛋白質(zhì)基礎(chǔ)配方中蛋白質(zhì)需求量不足有關(guān)。而菲牛蛭營(yíng)養(yǎng)成分蛋白質(zhì)含量84%(配合飼料養(yǎng)殖)～89%(野生菲牛蛭)[11]。在漁用配合飼料中， 蛋白質(zhì)含量是決定魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)快慢的關(guān)鍵因素， 飼料蛋白質(zhì)含量過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)在李軍基礎(chǔ)配方的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)NP-90比例為4%，NP-2002為5%，干飼料蛋白含量為73%，含水量為90.2%，接近血液水分含量，基本能滿(mǎn)足菲牛蛭的蛋白需求。

3.2 配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭水蛭素活性的影響分析

水蛭素(Hirudin)是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白質(zhì)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶特效抑制劑，是活血化淤的通經(jīng)良藥[13]。在菲牛蛭養(yǎng)殖中，水蛭素活性作為菲牛蛭養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。在貴州養(yǎng)殖條件下，朱忠勝[14]得出幼體菲牛蛭水蛭素活性為73.24±3.65 U/g。本實(shí)驗(yàn)中，水蛭活性血液組為76.1719±0.3906 U/g，配合飼料組為75.3906±0.3918 U/g，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，配合飼料組和血液組水蛭素活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明在養(yǎng)殖周期為60 d，配合飼料對(duì)菲牛蛭水蛭素?zé)o影響。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)投喂觀(guān)察，攝食效果較好，配合飼料組菲牛蛭身體無(wú)“僵硬、起結(jié)”現(xiàn)象、有輕微的反吐，死亡量少，攝食效果優(yōu)于血液組。

3.3 菲牛蛭嗉囊和腸道中(SOD和CAT)與MDA活性表現(xiàn)形式相反

嗉囊(crop)是菲牛蛭消化系統(tǒng)中比較寬而長(zhǎng)的部分(或稱(chēng)胃)，內(nèi)胚層開(kāi)始的位置，主要功能是儲(chǔ)藏食物。嗉囊的后端通過(guò)一幽門(mén)闊約肌開(kāi)口于腸(intestine)，是一根適度寬闊的縱管，主要功能是消化吸收[15]。SOD和CAT是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶。SOD 作用于超氧陰離子自由基，使之轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2)和氧氣((O2))，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受損傷，是機(jī)體抗氧化能力的指示器[16]。而CAT 可以將SOD 的作用產(chǎn)物H2O2還原成水(H2O)，保護(hù)機(jī)體免受H2O2的毒性作用[17]。菲牛蛭嗉囊和腸道中SOD和CAT變現(xiàn)為同高同低現(xiàn)象，這與廖雅麗[18]研究鹽度對(duì)云紋石斑魚(yú)抗氧化酶和張楠[19]重金屬鋅對(duì)大型溞SOD、CAT酶活性影響結(jié)果相似。這可能與SOD作用于超氧陰離子自由基，產(chǎn)生過(guò)多的H2O2底物誘導(dǎo)CAT活性隨著上升。MDA 是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)(稱(chēng)膜脂)過(guò)氧化作用形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其含量的高低可以反映出機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，并間接反映機(jī)體細(xì)胞受損傷程度[20]。機(jī)體中SOD和CAT處于較高水平時(shí)，清除過(guò)多的自由基，減少了自由基對(duì)生物膜脂質(zhì)的攻擊，導(dǎo)致MDA的含量減少。而本研究中，菲牛蛭腸道SOD和CAT活性較高，而MDA含量較低。嗉囊中SOD和CAT活性較低，而MDA含量較高。本實(shí)驗(yàn)表明：菲牛蛭嗉囊和腸道SOD和CAT與MDA活性表現(xiàn)形式相反。

3.4 配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭抗氧化指標(biāo)的影響分析

本實(shí)驗(yàn)在張軍[8]基礎(chǔ)配方的基礎(chǔ)上，調(diào)高了NP-2002和NP-2002的比例。NP-2002加工過(guò)程200℃噴霧干燥，93℃蒸發(fā)1～2 min；而NP-90是通過(guò)高速離心分離，250℃高溫滅菌而成，質(zhì)量性狀穩(wěn)定，不易變質(zhì)和滋生有害細(xì)菌。SOD 和CAT 是存在于生物體內(nèi)的非常重要的抗氧化防御性功能酶，在清除超氧自由基和氧化自由基，防止生物分子損傷方面發(fā)揮重要作用。而MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷[21]，MDA含量的多少能夠代表膜脂過(guò)氧化的程度，也可間接反映組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。研究表明：增加雜交鱘幼魚(yú)腸道[22]和中華絨鰲蟹[23]SOD和CAT 活力，并降低MDA含量，能提高魚(yú)體腸道的抗氧化能力。在菲牛蛭腸道組織中，配合飼料組SOD和CAT活性顯著高于血液組(P<0.05)，配合飼料組MDA含量也稍低于血液組。本實(shí)驗(yàn)表明：該配方對(duì)菲牛蛭腸道抗氧化能力有一定的增強(qiáng)作用。

菲牛蛭嗉囊主要功能是儲(chǔ)存血液，消化吸收功能較弱。食物來(lái)源以吸食動(dòng)物血液為主，并長(zhǎng)期保存于嗉囊中，而動(dòng)物血液離體后，質(zhì)量不穩(wěn)定，易污染、易腐敗和易滋生有害細(xì)菌。在不斷的進(jìn)化過(guò)程中，菲牛蛭形成了自己獨(dú)特的消化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)[15]。李軍[8]實(shí)驗(yàn)表明配合飼料飼養(yǎng)菲牛蛭成活率100%，血液組成活率為75%。這可能與血液的易質(zhì)性導(dǎo)致嗉囊組織細(xì)胞抗氧化損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中配合飼料組嗉囊中MDA含量和SOD活性顯著低于血液組(P<0.05)，CAT也稍低于血液組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在菲牛蛭嗉囊組織中，配合飼料減少了SOD活力，但在MDA含量上配合飼料達(dá)到或超過(guò)血液飼養(yǎng)水平。

參考文獻(xiàn)：

[1] Steiner V， Knecht R， Boernsen K O，etal. Primary structure and function of novel O-glycosylated hirudins from the leech Hirudinaria manillensis[J].Biochemistry， 1992， 31(8)：2294-8.

[2] William P， Shettield W， Sharon G，etal. Combined administration of barbourin-albumin and hirudin-albumin fusion Proteins limits librin(ogen) deposition on the rabbit balloon-injured aorta[J].ThrombosisResearch， 2006(32)： 234-245.

[3] Puurunen M， Lassila R. Suceessful treatment of mesenterial venous thrombosis with recombinant hirudin[J].ThrombosisResearch， 2006， 118：241-245.

[4] 朱忠勝， 姚俊杰， 宋 嬌， 等. 引種菲牛蛭攝食與生長(zhǎng)的研究[J]. 淡水漁業(yè)， 2016， 46(3)： 71-75.

[5] 于 翔. 菲牛蛭室內(nèi)高密度養(yǎng)殖技術(shù)研究[D]. 廣州：中山大學(xué)， 2009.

[6] 張 彬， 李浩華， 林 強(qiáng)， 等. 菲牛蛭細(xì)菌性疾病的病原檢驗(yàn)及藥物防治[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)， 2009， 16(6)： 878-890.

[7] 張 彬， 于 翔， 汪 波， 等. 菲牛蛭交配及卵繭人工孵化初步研究[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志， 2011， 46(4)： 78-83.

[8] 李 軍， 于 翔， 龔 元， 等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)選菲牛蛭飼料配方研究[J]. 中草藥， 2014， 45(6)： 782-785.

[9] 高勝濤. 菲牛蛭消化系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的研究[D]. 西南大學(xué)， 2016.

[10] 陳華友， 邢自力， 李媛媛， 等. 凝血酶滴定法測(cè)定水蛭素活性的改進(jìn)[J]. 生物技術(shù)， 2002， 12(6)： 24-25.

[11] 張 彬. 菲牛蛭(HirudinariamanillensisLesson，1842)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)、生化成分及其抗凝活性研究[D]. 廣州：中山大學(xué)， 2008.

[12] 錢(qián)雪橋， 崔奕波， 解綬啟， 等. 養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)飼料蛋白需要量的研究進(jìn)展[J]. 水生生物學(xué)報(bào)， 2002， 26(4)： 410-416.

[13] 黃 勝， 熊 偉， 姚俊杰，等. 水蛭素提取純化研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志， 2017， 37(2)： 313-315.

[14] 朱忠勝. 貴州地區(qū)菲牛蛭養(yǎng)殖及水蛭素活性研究[D]. 貴陽(yáng)：貴州大學(xué)， 2016.

[15] 楊 潼.中國(guó)動(dòng)物志(環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)·蛭綱)[M].北京：科學(xué)出版社出版，1996.

[16] Shen W Y， Fu L L， Li W F，etal. Effect of dietary supplementation with Bacillus subtilis on the growth， performance， immune response and antioxidant activities of the shrimp (Litopenaeus vannamei)[J].AquacultureResearch， 2010， 41(11)： 1691-1698.

[17] 丁金強(qiáng)， 劉 萍， 李 健， 等. 不同地理群體日本蟳非特異性免疫及抗氧化酶活力的比較[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2013， 37(2)： 275-280.

[18] 廖雅麗， 張晨捷， 彭士明， 等. 鹽度對(duì)云紋石斑魚(yú)抗氧化酶及溶菌酶活性的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 25(2)： 169-176.

[19] 張 楠， 張清靖， 賈成霞， 等. 重金屬鋅對(duì)大型溞SOD、CAT酶活性和GSH含量的影響[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2017， 39(1)： 69-75.

[20] 李 源， 溫安祥， 駱美琳. 谷氨酰胺促泥鰍生長(zhǎng)機(jī)理的初步研究[J]. 飼料工業(yè)， 2014， 35(2)： 37-43.

[21] 王 偉， 姜志強(qiáng)， 孟凡平， 等. 急性溫度脅迫對(duì)太平洋鱈仔稚魚(yú)成活率、生理生化指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)， 2012， 31(8)： 463-466.

[22] 吳俊光， 王連生， 王常安， 等. 飼料中精氨酸水平對(duì)雜交鱘幼魚(yú)抗氧化能力及血清生化指標(biāo)的影響[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 31(3)： 272-279.

[23] 孫學(xué)亮， 郭永軍， 季延濱， 等. 3種復(fù)方中草藥對(duì)中華絨鰲蟹生長(zhǎng)和部分抗氧化指標(biāo)的影響[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2015， 19(2)： 86-94.