江星伯 蔣玲 龔玲 宋坤嶺 余雪云 覃遠漢

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科（南寧 530021）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）的關(guān)鍵因素和中心環(huán)節(jié)是腎小管上皮細胞（renal tubular epithelial cell，RTEC）損傷和功能不全［1］，缺氧是引起RIF發(fā)生發(fā)展的一個重要微環(huán)境因素，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activiated protein kinases，MAPK）超家族中的應(yīng)激活化蛋白激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）可在缺氧條件下被激活［2］。有研究表明［3-5］，在腎小管損傷中存在大量JNK的激活，JNK可能在缺血缺氧損傷中發(fā)揮重要作用。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纖維細胞（myofibroblast，MF）的標志性蛋白，RIF常出現(xiàn)腎臟固有細胞表型轉(zhuǎn)分化，大量表達α-SMA，因此α-SMA的表達變化在RIF中具有重要意義。HONMA等［6］報道，腎臟組織的JNK蛋白的表達量與組織纖維化和腎功能不全呈正相關(guān)。JNK在體外培養(yǎng)的大鼠RTEC缺氧性損傷中對α-SMA的作用，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究報道，為此我們通過檢測JNK、pJNK和α-SMA在大鼠RTEC缺氧性損傷表達變化，初步探討JNK通路在缺氧性RTEC轉(zhuǎn)分化中的作用，為防治RIF提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠腎小管上皮細胞株（NRK-52E）購自上海生物細胞庫。DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、混合胎牛血清均購自美國Gibco公司，青、鏈霉素和JNK通路特異性阻斷劑SP600125均購自碧云天公司，缺氧真空罐購自加拿大Stemcell公司，Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自美國Thermo公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒購自德國 Roche公司，5×電泳液、10×電轉(zhuǎn)液、20×TBS溶液、Tween-20均購自北京索萊寶公司，PVDF膜購自美國Immobilon-P公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，引物設(shè)計及合成均由寶生物工程（大連）有限公司完成，JNK抗體、pJNK抗體和β-actin抗體購自美國CST公司，α-SMA抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST公司，Chemiluminescent HRP Substrate購自美國Millipore公司，F(xiàn)luorChem M購自美國Protein Simple公司，實時熒光定量PCR儀7500購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 上皮細胞培養(yǎng)與缺氧損傷模型構(gòu)建大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）培養(yǎng)在7%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、50 mL/L二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至約70%融合時傳代。待傳代的細胞生長至對數(shù)期時，將細胞隨機分為5組：正常組、缺氧組、抑制劑組、激動劑組、DMSO組。正常組在正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，不予以缺氧損傷處理。抑制劑組加入含有JNK通路特異性阻斷劑SP600125（10、20 μmol/L，溶于DMSO中）的DMEM培養(yǎng)基5 mL培養(yǎng)30 min后與缺氧組、DMSO組（加入含有與抑制劑等體積的DMSO的DMEM培養(yǎng)基5 mL）移入真空缺氧罐中進行缺氧性損傷處理［7］，分別于缺氧處理6、12、24 h后均復(fù)氧30 min，收集細胞進行分子生物學指標檢測。

1.3 α-SMA mRNA表達檢測采用RT-PCR法。按Trizol RNA提取試劑盒說明提取各組的總RNA，為減少誤差，每組重復(fù)3次。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明要求選擇符合條件的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄。β-actin為內(nèi)參進行RT-PCR，α-SMA上游引物：5′-CTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3′，下游引物：5′-GCATTTGCGGTGGACAATGGA-3′，片段長度：342 bp。 β-actin 上 游 引 物 ：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，片段長度：124 bp。反應(yīng)總體系20.0 μL：上、下游引物各0.8 μL，Mix 9 μL，模板 1.5 μL，ddH2O 7.9 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，循環(huán)1次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)40次。每個樣本設(shè)3個副孔，取其平均值為樣本Ct值。以正常組的基因表達量為1，采用2-△△Ct法計算其余各組mRNA的相對表達量。變化倍數(shù)（Fold change）為各組較正常組基因的相對表達倍數(shù)。

1.4 JNK、pJNK、α-SMA蛋白表達檢測采用Western blotting法。模型建立后，按放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液說明書抽提各組RTEC總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析法測定蛋白濃度。煮沸變性后取30 μg上樣，進行Western Blotting。常溫下十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，一抗JNK抗體（稀釋度1∶1 000）、pJNK抗體（稀釋度1∶1 000）、α-SMA抗體（稀釋度1∶1 000）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋度1∶2 000）常溫孵育1.5 h，利用化學發(fā)光液在FluorChem M下，檢測蛋白條帶灰度值，以β-actin基因蛋白作為參照，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白作為蛋白的相對表達量，采用Alpha View軟件對結(jié)果進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RTEC的 α-SMA mRNA表達變化與正常組比較，缺氧 6、12、24 h組 RTEC 的 α-SMA mRNA表達均顯著增加（均P＜0.05），缺氧時間越長，α-SMA的mRNA表達越顯著；與缺氧組相比，DMSO組RTEC的α-SMA mRNA表達改變差異均無顯著性（均P＞ 0.05），抑制劑組（10、20 μmol/L）RTEC的α-SMA mRNA表達均顯著降低（均P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組RTEC的JNK、pJNK和α-SMA蛋白表達變化與正常組比較，缺氧6、12、24 h組RTEC的pJNK、α-SMA蛋白表達均顯著增加（P＜0.05），缺氧時間越長，JNK、pJNK和α-SMA蛋白的表達越顯著；與缺氧組相比，DMSO組RTEC的JNK、pJNK、α-SMA蛋白表達差異均無顯著性（均P＞0.05），抑制劑組（10、20 μmol/L）RTEC的pJNK、α-SMA蛋白表達均顯著降低（均P＜0.05），JNK蛋白表達均顯著增加（均P＜0.05）。見圖2。

圖1 各組細胞α-SMA mRNA表達數(shù)據(jù)水平Fig.1 Analysis of alpha-SMA expression in each group

圖2 各組細胞JNK、pJNK和α-SMA蛋白條帶圖及數(shù)據(jù)分析Fig.2 Banding patterns and data analysis of JNK,pJNK and α-SMA in each group of cells

2.3 缺氧性RTEC損傷中pJNK蛋白表達與α-SMA蛋白表達的相關(guān)性分析在缺氧性RTEC損傷中，pJNK蛋白表達與α-SMA蛋白表達呈顯著正相關(guān)（r=0.950，P＜ 0.01）。

3 討論

RIF是導(dǎo)致多種急、慢性腎病終末期的主要原因和共同病理過程［8］，主要病理變化是細胞外基質(zhì)的代謝失衡。本課題組的前期研究顯示，在RIF中腎臟組織的α-SMA呈現(xiàn)高表達［9］。許春杰等［10］報道，肝纖維化中α-SMA出現(xiàn)高表達。缺血缺氧應(yīng)激狀態(tài)下，腎小管上皮細胞為適應(yīng)微環(huán)境的改變，發(fā)生細胞表型的轉(zhuǎn)分化，由上皮細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，同時加重局部炎癥反應(yīng)，增加致纖維化因子的表達，α-SMA則是這種表型轉(zhuǎn)分化的標志蛋白［11］，轉(zhuǎn)分化形成的肌成纖維細胞不斷增加引起的細胞外基質(zhì)沉積、代謝紊亂是引起RIF的關(guān)鍵因素之一［12］。因此，研究腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的機制對防治RIF具有重要意義。

JNK是一種可以有效磷酸化c-Jun氨基末端的唯一的蛋白激酶，又叫應(yīng)激激活蛋白激酶（SAPKs），屬于進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPKs超家族成員之一［13］。JNK通路可被多種應(yīng)激刺激（如紫外線、高滲、缺血缺氧等）、細胞因子、生長因子以及某些G蛋白偶聯(lián)受體激活，其基因可以編碼46和55 kD兩種蛋白產(chǎn)物，通過選擇性剪接形成10種剪接變體［14］，在不同組織發(fā)揮不同的功能及作用。有研究表明，JNK通路與組織纖維化中細胞的轉(zhuǎn)分化作用有密切聯(lián)系。ZHAO等［15］報道，在成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的過程中，JNK在其中起到調(diào)控作用。KLUWE等［16］認為，JNK參與了肝纖維化中轉(zhuǎn)分化過程和纖維生成，其可能成為抗纖維化治療的潛在靶標，以上研究提示JNK參與了組織纖維化中的轉(zhuǎn)分化過程。

本研究通過建立缺氧性RTEC損傷模型，于缺氧后6、12、24 h分別檢測細胞的α-SMA的mRNA表達，JNK、pJNK和α-SMA的蛋白表達。結(jié)果顯示，缺氧使細胞的pJNK蛋白表達顯著增加，缺氧時間越長，活化JNK蛋白表達越高，同時α-SMA m-RNA和蛋白表達也顯著增加，高α-SMA表達提示RTEC表型轉(zhuǎn)分化不斷加重，提示在缺氧條件下，缺氧時間越長，缺氧誘導(dǎo)磷酸化的JNK越多，通路激活程度越高。相關(guān)性分析顯示RTEC中的pJNK蛋白表達與α-SMA蛋白表達呈顯著正相關(guān)。加入JNK通路特異性阻斷劑后細胞的JNK蛋白表達增加，pJNK蛋白表達均顯著減少，pJNK蛋白表達/JNK蛋白表達減少。抑制劑濃度增加時，JNK蛋白表達增加越顯著，pJNK蛋白表達和pJNK蛋白表達/JNK蛋白表達減少越顯著，同時抑制JNK通路后，α-SMA的m-RNA和蛋白表達均顯著降低，提示抑制JNK通路的活化后，減少RTEC發(fā)生表型轉(zhuǎn)分化，因此α-SMA的表達減少，JNK通路被抑制的程度越高，α-SMA的表達越低。與缺氧組相比，DMSO組各項指標均沒有顯著差異，提示用于溶解SP600125的DMSO并沒有參與RTEC缺氧性損傷。綜上所述，在大鼠RTEC缺氧性損傷中，JNK通路可能參與了RTEC表型轉(zhuǎn)分化作用。本研究雖然初步討論了JNK通路在缺氧性RTEC轉(zhuǎn)分化中的作用，但并未能明確其具體分子機制，同時與JNK通路相關(guān)的其他通路在RTEC轉(zhuǎn)分化中的作用如何，仍需進一步的研究證實。

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