李建雄，李鳴明，卜玉潔，李斌，鄒華，張廷華

腦缺血性損傷已成為危害人類生命健康的危重病之一，其導致的神經元不可逆死亡可以造成神經功能和行為學障礙甚至死亡[1-4]。目前唯一可用于治療急性缺血性卒中的藥物是組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)。但是，tPA治療必須在中風發(fā)作后4.5h內進行[5]，一旦超過4.5h的治療窗口，溶栓導致的顱內出血風險明顯增加[6]。因此目前臨床上迫切需要開發(fā)新的腦缺血性損傷保護藥物或探索新的治療思路[7]。

17-烯丙基氨基-17-甲基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)是熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)抑制劑。大量研究表明，17-AAG能夠抑制肺腺癌、膽管癌等多種腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡[8-10]。此外，有研究表明，在創(chuàng)傷性腦損傷中17-AAG可以發(fā)揮神經保護作用[11-13]。同時，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，17-AAG可以抑制短暫性全腦缺血誘導的大鼠海馬神經元死亡[14]。但是，17-AAG在腦缺血過程中發(fā)揮神經保護作用的機制還未見報道。Kim等[13]研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷性腦損傷中，17-AAG可以通過誘導小膠質細胞和神經元中HSP70的表達進而發(fā)揮神經保護作用。此外，在前期動物實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)17-AAG可以誘導短暫全腦缺血組織中HSP70的表達[13]。因此，我們推測17-AAG可能通過上調HSP70的表達來抑制氧糖剝奪復糖復氧模型(oxygenglucose deprivation and recovery，OGD/R)誘導的大鼠海馬神經元凋亡。為驗證此設想，本研究擬以大鼠海馬神經元OGD/R為基礎，探索17-AAG對神經元的保護作用以及HSP70在17-AAG發(fā)揮神經保護作用中的角色。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 出生1d的SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM、胎牛血清和B27添加劑均購自美國Gibco公司，TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司，DAPI染色液和BCA蛋白測定試劑盒購自德國Sigma公司，兔抗大鼠HSP70和β-actin抗體以及山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司，大鼠HSP70干擾慢病毒購自世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經元的培養(yǎng) 取出生1d內的SD大鼠，消毒后斷頭，用鑷子分離海馬區(qū)并剪碎，加入1ml胰酶(0.125%)，在37℃條件下消化腦組織約20min，利用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化10min，然后離心(1500r/min，3min)，重懸沉淀后接種至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)72h，加入終濃度為1×10-5mol/L的阿糖胞苷作用48h，此后每3d更換半量培養(yǎng)基。

1.2.2 OGD/R模型的建立 為在體外模擬腦缺血時神經元所處的病理條件，我們參考文獻[15-16]中報道的方法建立OGD/R模型。首先將無糖DMEM放入缺氧艙(5%CO2，95%N2)內4h以上，然后將培養(yǎng)了12d的神經元中的培養(yǎng)基更換為上述已準備好的無糖DMEM培養(yǎng)基，最后放入缺氧艙中，置于37℃條件下分別氧糖剝奪0.5、1、2h，隨后更換為正常培養(yǎng)基，在正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.3 實驗分組和處理 實驗一：為研究OGD/R對大鼠海馬神經元凋亡的影響，將大鼠海馬神經元分為對照組(Con組)，即正常培養(yǎng)，不給任何干預；OGD/R (0.5h)組：即對細胞進行氧糖剝奪0.5h，復糖復氧培養(yǎng)24h；OGD/R(1h)組：即對細胞進行氧糖剝奪1h，復糖復氧24h)；OGD/R (2h)組：即對細胞進行氧糖剝奪2h，復糖復氧24h。實驗二：為研究17-AAG對OGD/R誘導的大鼠海馬神經元凋亡的影響，將細胞分為DMSO組(對OGD/R模型細胞給予DMSO處理24h)，17-AAG 0.5μmol/L組(對OGD/R模型細胞給予17-AAG 0.5μmol/L處理24h)，17-AAG 1μmol/L組(對OGD/R模型細胞給予17-AAG 1μmol/L處理24h)，以及17-AAG 2μmol/L組(對OGD/R模型細胞給予17-AAG 2μmol/L處理24h)。實驗三：為探討17-AAG對OGD/R處理后大鼠海馬神經元中HSP70蛋白表達的影響，將細胞分成DMSO組，即正常培養(yǎng)，僅添加DMSO；OGD/R處理組，即對細胞氧糖剝奪1h、復糖復氧24h；OGD/R+17-AAG組，對細胞氧糖剝奪1h、復糖復氧24h，同時17-AAG 1μmol/L處理24h。實驗四：為確認本研究構建的HSP70干擾對17-AAG+OGD/R聯(lián)合處理條件下的大鼠海馬神經元凋亡的影響，將細胞分成RNAi con組，即對細胞氧糖剝奪1h、復糖復氧24h，同時17-AAG 1μmol/L和RNAi對照聯(lián)合處理24h；HSP70 RNAi組，即對細胞氧糖剝奪1h、復糖復氧24h，同時17-AAG 1μmol/L和HSP70 RNAi聯(lián)合處理24h。

1.2.4 TUNEL實驗 將按照分組處理的神經元先用PBS洗2次，然后通過4%的多聚甲醛固定25min，固定完畢后用PBS浸洗2次，然后利用含0.2% Triton X-100的PBS處理細胞3min，PBS浸洗，最后加入TUNEL染色液，在37℃條件下孵育1h，孵育完成后利用PBS洗4次，每次7min，再利用DAPI染核，PBS洗后加入含有抗熒光淬滅的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blotting檢測神經元中HSP70蛋白的表達 將按照分組處理的大鼠神經元細胞用PBS洗滌2次，收集細胞并離心，加入蛋白抽提裂解液處理8min；處理完畢后，用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量；在蛋白樣品中加入2×上樣緩沖液，于沸水中變性。變性完成后，每孔上樣100μg總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜；利用含5%脫脂奶粉的封閉液在室溫條件下封閉1h；隨后加入一抗，于4℃條件下過夜，TBST洗膜4次、每次10min；加入目的二抗，于37℃條件下孵育1h，TBST洗膜4次。最后利用ECL化學發(fā)光法進行顯影，以β-actin作為內參進行蛋白相對表達量分析。

1.2.6 HSP70干擾 shRNA慢病毒載體構建從G e n B a n k中獲得大鼠H S P 7 0基因序列信息(NM_031971.2)，由世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司設計合成HSP70 shRNA序列：正向5'-CCGGG TCCTATGCCTTCAACATGAACTCGAGCATGTTG AAGGCATAGGACTCTTTTTTG-3'，反向5'-AATTC AAAAAAGAGTCCTATGCCTTCAACATGCTCGAG TTCATGTTGAAGGCATAGGAC-3'。通過退火形成雙鏈，再重組入已經線性化的載體LV-hU6-shRNACMV-EGFP中，經測序鑒定后利用293T細胞包裝慢病毒顆粒，病毒經純化、濃縮后進行滴度測定，并于–80℃冰箱中保存。

1.2.7 慢病毒感染大鼠海馬神經元 將構建好的慢病毒顆粒按照不同感染復數(shù)(MOI)20、40、80感染神經元，感染12h后更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h后通過熒光顯微鏡觀察細胞感染效率或進行后續(xù)的細胞處理。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間滿足方差齊性條件下采用t檢驗進行分析；多組間在方差齊性基礎上采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用Dunnettt檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠海馬神經元的培養(yǎng)情況 神經元分離后接種2h開始貼壁；12s后胞體飽滿，呈錐體形、橢圓形、圓形、多邊形，胞體延伸出大量突起。

2.2 OGD/R對大鼠海馬神經元凋亡的影響TUNEL實驗結果表明，神經元凋亡率在Con組為11.38%±4.59%，在OGD/R(0.5h)組為25.08%±2.96%，在OGD/R(1h)組為41.93%±3.90%，在OGD/R(2h)組為50.54%±4.39%。與Con組相比，氧糖剝奪1h和2h的神經元凋亡率均明顯提高，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。所以在后續(xù)實驗中OGD/R選擇氧糖剝奪1h、復糖復氧24h作為實驗條件。

2.3 17-AAG對OGD/R誘導的大鼠海馬神經元凋亡的影響 本研究通過TUNEL實驗檢測不同濃度(0.5、1、2μmol/L)的17-AAG對氧糖剝奪1h、復氧復糖24h處理后神經元凋亡的影響。結果顯示，神經元凋亡率在DMSO組為46.31%±2.86%，在17-AAG 0.5μmol/L處理組為38.31%±3.02%、在17-AAG 1μmol/L處理組為22.22%±3.63%，在17-AAG 2μmol/L處理組為17.82%±1.58%。與DMSO組比較，3種濃度的17-AAG均能明顯降低OGD/R誘導的大鼠海馬神經元凋亡(圖2)，故在后續(xù)實驗中選擇1μmol/L作為17-AAG濃度處理神經元。

2.4 17-AAG對OGD/R誘導的大鼠海馬神經元中HSP70表達的影響 Western blotting結果顯示，DMSO組、OGD/R處理組和OGD/R+17-AAG組神經元中HSP70蛋白的相對表達量分別為1.33±0.09、0.22±0.03和0.46±0.05；與對照組相比，OGD/R處理組中HSP70蛋白相對表達量明顯降低(P<0.01)；與OGD/R組相比，OGD/R+17-AAG組神經元中HSP70蛋白相對表達量明顯升高(P<0.01；圖3)。

2.5 HSP70干擾慢病毒質粒測序鑒定 結果表明，測序獲得的載體中干擾序列信息與設計合成的HSP70干擾慢病毒質粒靶點信息完全一致(圖4)。

2.6 HSP70干擾慢病毒最佳感染復數(shù)篩選 本研究利用不同MOI值的病毒感染大鼠神經元以篩選最佳的病毒與細胞比例。熒光顯微鏡觀察結果表明當MOI=80時，慢病毒對神經元的感染效率最高(圖5)。

2.7 HSP70干擾逆轉17-AAG對OGD/R誘導的大鼠海馬神經元的保護作用 Western blotting結果表明，RNAi con組和HSP70 RNAi組大鼠海馬神經元中HSP70的相對表達分別為0.45±0.04和0.17±0.02。與RNAi con組相比，HSP70 RNAi組HSP70的表達明顯下調(P<0.01，圖6)。同時，本研究通過TUNEL實驗進一步檢測HSP70干擾對17-AAG+OGD/R處理條件下的大鼠海馬神經元凋亡的影響，結果顯示，HSP70 RNAi組大鼠海馬神經元凋亡率(42.64%±3.84%)明顯高于RNAi con組(11.31%±1.92%，P<0.01，圖7)。

圖1 OGD/R誘導大鼠海馬神經元凋亡(TUNEL ×200，n=3)Fig.1 OGD/R induced rat hippocampal neurons apoptosis (TUNEL ×200, n=3)

圖2 17-AAG抑制OGD/R誘導的大鼠海馬神經元凋亡 (TUNEL ×200，n=3)Fig.2 17-AAG suppressed rat hippocampal neurons apoptosis induced by OGD/R (TUNEL ×200, n=3)

圖3 17-AAG對OGD/R誘導的大鼠海馬神經元中HSP70表達的影響(Western blotting，n=3)Fig.3 The effect of 17-AAG on the expression of HSP70 protein in rat hippocampal neurons treated with OGD/R (Western blotting, n=3)

圖4 測序結果Fig.4 Sequencing results

圖5 慢病毒感染的大鼠海馬神經元(熒光顯微鏡×200)Fig.5 Rat hippocampal neurons infected by lentivirus (Fluorescence microscope ×200)

圖6 HSP70干擾抑制17-AAG+OGD/R處理組大鼠海馬神經元中HSP70的表達(Western blotting，n=3)Fig.6 HSP70 protein was down-regulated by HSP70 RNAi in rat hippocampal neurons treated with 17-AAG and OGD/R(Western blotting, n=3)

3 討 論

目前，腦缺血已成為嚴重危害我國居民生命和健康的疾病之一。缺血再灌注后引發(fā)氧化應激、炎癥反應等級聯(lián)反應，最終引起神經元的損傷和死亡，從而導致神經功能和行為障礙[17]。因此，抑制神經元的不可逆死亡有望改善腦缺血患者的神經功能。

圖7 HSP70干擾提高17-AAG+OGD/R處理組大鼠海馬神經元的凋亡率(TUNEL ×200，n=3)Fig.7 HSP70 RNAi induced the apoptosis of rat hippocampal neurons treated with 17-AAG and OGD/R (TUNEL ×200, n=3)

在既往短暫全腦缺血動物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)17-AAG可以明顯抑制大鼠海馬神經元凋亡，減少腦梗死體積，改善大鼠的學習和記憶能力，有望成為腦缺血后抑制神經損傷的有效藥物[14]。為了進一步證明17-AAG在神經保護中的作用，本研究通過體外培養(yǎng)大鼠海馬神經元構建OGD/R模型模擬在體腦缺血再灌注損傷。首先，在實驗中我們選擇了3個氧糖剝奪的時間點，即0.5、1、2h，然后再灌注24h，利用TUNEL免疫熒光實驗檢測各組神經元的凋亡情況。結果表明，氧糖剝奪時間為1h和2h時，神經元的凋亡率均明顯升高。Wang等[15,18]的研究表明，體外培養(yǎng)的神經元在氧糖剝奪2h后復糖復氧24h細胞凋亡明顯增加，這說明本研究構建的OGD/R模型是成功的。最后，我們將后續(xù)研究采用的OGD/R參數(shù)確定為氧糖剝奪1h、復糖復氧24h。同時，我們通過TUNEL檢測了不同濃度的17-AAG對OGD/R誘導的神經元凋亡的影響。結果表明，0.5、1、2μmol/L 3種濃度的17-AAG均能抑制OGD/R誘導的神經元凋亡，且濃度越高抑制效果越明顯。這與本課題組前期在動物實驗中發(fā)現(xiàn)的結果一致。因此，本研究在體外實驗中獲得的結果進一步證明了17-AAG在神經保護中的作用。但是，17-AAG發(fā)揮神經保護作用的機制仍不清楚，還須進一步深入研究。

既往報道HSP70可以通過調節(jié)細胞死亡信號影響細胞的存活[19-20]。在創(chuàng)傷性腦缺血動物模型和細胞模型中，HSP70已被證明具有神經保護作用[21-23]。在既往短暫全腦缺血動物實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)17-AAG可以誘導缺血區(qū)HSP70蛋白的表達[14]。同時，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OGD/R明顯抑制神經元細胞中HSP70蛋白的表達，而17-AAG可以誘導OGD/R處理的神經元細胞中HSP70蛋白的表達。因此，我們推測HSP70在17-AAG抑制OGD/R誘導的神經元凋亡中扮演重要角色。為了驗證我們的推斷，本研究構建了HSP70 RNA干擾慢病毒，抑制17-AAG+OGD/R處理條件下神經元中HSP70的表達。TUNEL實驗結果表明，HSP70干擾逆轉了17-AAG對OGD/R處理的神經元凋亡的保護作用，這說明HSP70確實在17-AAG誘導的神經保護中具有重要作用。

綜上所述，本研究表明17-AAG可以通過上調HSP70的表達來抑制OGD/R誘導的神經元凋亡，為腦缺血性損傷的治療提供了新的潛在藥物和靶點。

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