常樂，詹元龍，劉長莉

東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是微生物合成的一類線性高分子聚酯的總稱[1]。自1926年Lemoigne在巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium中首次發(fā)現(xiàn)聚羥基丁酸酯(P3HB)以來[2]，已有超過150種PHAs單體被發(fā)現(xiàn)[3]。聚3-羥基丙酸脂 (Poly(3-hydroxypropionate)，P3HP)是PHAs家族中新出現(xiàn)的一種聚酯，具有優(yōu)異的材料學(xué)性質(zhì)和機械性能，如高機械強度和拉伸強度、生物降解性、生物相容性等，被認為是石化合成塑料的重要代替品之一，具有廣泛的應(yīng)用價值與開發(fā)前景[4]。

迄今還未見野生微生物天然合成P3HP的報道，以往P3HP多采用化學(xué)方法合成，其中以β-丙內(nèi)酯開環(huán)聚合 (ROP)和3-HP酯類縮合兩種方法為主。前者雖然可以通過開環(huán)聚合產(chǎn)生高分子量的P3HP，但其反應(yīng)過程會產(chǎn)生強烈的致癌物質(zhì)[5-6]，對生物和環(huán)境產(chǎn)生威脅；后者可利用無毒3-HP直接縮合生成P3HP，但產(chǎn)生的聚合物分子量不穩(wěn)定，難以控制生產(chǎn)過程[7]，因此兩者均不適用于規(guī)?；虡I(yè)生產(chǎn)。Zhang等[8]結(jié)合了縮合反應(yīng)和開環(huán)聚合反應(yīng)兩者的優(yōu)勢，使用將3-HP單體優(yōu)先制備成大環(huán)單體的兩步法化學(xué)合成P3HP，其分子量(Mn)可達2.4?67 kg/mol。為了避免聚合反應(yīng)中使用大量有機溶劑造成的環(huán)境污染和開環(huán)聚合中有害中間體產(chǎn)生的問題，方孝斌等[9]以自制的3-HP為單體，采用金屬鉿作為新型催化劑，在甲苯和氮氣的保護下直接催化縮聚制備高分子量的P3HP，P3HP的數(shù)均分子量可達到14.7 kg/mol，這種方式合成的高分子P3HP呈現(xiàn)出很好的成膜特性和穩(wěn)定性。除此之外，通過添加P3HP結(jié)構(gòu)類似的前體物，如 3-HP、丙烯酸[10]或 1,3-丙二醇(1,3-PDO)[11]等，也能達到合成P3HP的目的。

綜合研究表明，化學(xué)法制備P3HP的合成效率不高，且污染環(huán)境。而添加的P3HP結(jié)構(gòu)類似前體物價格昂貴，且添加生產(chǎn)方式有細胞毒性從而抑制菌體生長，不適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)[12]。因此近年來，采用基因工程方法構(gòu)建能夠利用廉價、可再生碳源合成P3HP的工程菌株已逐漸成為研究的熱點。P3HP的生物合成路徑主要包括甘油途徑和丙二酸單酰輔酶A(Malonyl-CoA)途徑。其中丙二酸單酰輔酶A是脂肪酸中心代謝路徑中重要的限速步驟，亦是細菌脂肪酸合成途徑中理想的調(diào)控樞紐。Zhang課題組[13]研究的丙二酸單酰輔酶A生物傳感器對脂肪酸代謝的動態(tài)調(diào)控與穩(wěn)態(tài)維持機制的應(yīng)用對P3HP的合成有著至關(guān)重要的作用。此外，最新研究開發(fā)的P3HP合成路線——β-丙氨酸途徑，可以在降低生產(chǎn)成本的同時提高合成P3HP效率，具有一定發(fā)展?jié)摿?。本文針對P3HP生物合成的研究進展進行概括總結(jié)。

1 生物法合成P3HP

1.1 甘油途徑

近些年，甘油作為生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物，已成為合成各種生物制品最具吸引力的碳源[14]，其可用量已超過化學(xué)、制藥和化妝品行業(yè)等傳統(tǒng)消費的需求，且來源便利。在以甲醇進行植物油或動物脂肪的酯交換反應(yīng)中，10%的產(chǎn)物都為甘油[15-16]，致使甘油價格急劇下降。因此，以廉價的甘油為原料合成P3HP能夠降低成本，提高經(jīng)濟效益。

Andree?en等[4]將專性厭氧菌丁酸梭菌Clostridium butyricum的甘油脫水酶基因dhaB1Cb、腸道沙門氏菌Salmonella enteric中的丙醛脫氫酶基因pduPSe和真氧產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha的PHA聚合酶基因phaCRe轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli，以純甘油為唯一碳源，采用兩步補料分批發(fā)酵法合成P3HP，在好氧階段菌體生長與繁殖，厭氧階段通過添加還原劑促進產(chǎn)物大量積累。最終結(jié)果顯示，P3HP最高產(chǎn)量可達1.4 g/L，占細胞干重的12%。經(jīng)過Andree?en等[4]進一步分析后發(fā)現(xiàn)，由于甘油脫水酶DhaB1Cb僅在嚴格的厭氧條件下具有活性，為了維持厭氧條件必須添加還原劑 (延胡索酸二鈉和酒石酸鉀鈉)，不僅增加了生產(chǎn)成本，且與其他途徑合成的P3HP相比，產(chǎn)量相對較低，需要進一步開發(fā)甘油高產(chǎn)P3HP的發(fā)酵工藝。

在此研究基礎(chǔ)上，Wang等[17]使用對氧氣敏感性較低的肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumonia中維生素B12依賴型甘油脫水酶基因dhaB123Kp及輔助基因gdrABKp代替dhaB1Cb，并將來自鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium的丙醛脫氫酶基因pduPSt及來自R.eutropha的PHA聚合酶基因phaC1Re表達于E.coli中。在該優(yōu)化策略中，省略了Andree?en等[4]實驗中的P3HP厭氧累積階段，即避免了延胡索酸二鈉和酒石酸鉀鈉還原劑的添加，且在縮減發(fā)酵程序和添加劑的同時降低了生產(chǎn)成本。此外，添加維生素B12可維持代謝途徑中甘油脫水酶的活性；同時添加葡萄糖作為輔助劑，將葡萄糖分解代謝產(chǎn)生的生物質(zhì)能量及甘油用于P3HP生產(chǎn)，從而提高產(chǎn)量。該合成方法僅采用有氧發(fā)酵即可使得P3HP產(chǎn)量達10.1 g/L，占細胞干重的46.4%(圖1)。盡管甘油法合成P3HP已經(jīng)取得了非常大的進展，但仍存在一些問題尚待解決。例如，添加維生素B12導(dǎo)致發(fā)酵成本增加，而采用生產(chǎn)維生素B12的菌株K.pneumonia作為P3HP合成的宿主菌，就可以解決該問題。另外，發(fā)酵生產(chǎn)中的氧化還原平衡問題也困擾P3HP的合成，此問題可能通過引入消耗NADH的合成代謝途徑來解決。

為了避免維生素B12的添加，Heinrich等[18]引入維生素B12的天然生產(chǎn)者Shimwellia blattae作為載體，在S.blattae中表達惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的1,3-PDO脫氫酶基因dhaTPp和醛脫氫酶基因aldDPp、丙酸梭菌Clostridium propionicumX2的丙酸酯輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因pctCp及R.eutrophaH16的PHA聚合酶基因phaC1Re(圖1)，實現(xiàn)不添加維生素B12也可以高產(chǎn)P3HP的設(shè)想。除此之外，與Andree?en等[4]描述的兩相發(fā)酵方法相反，該發(fā)酵過程采用厭氧-好氧兩階段培養(yǎng)，不僅實現(xiàn)獲得比完全厭氧生產(chǎn)過程中更高的細胞干重，且在好氧階段減少了前體3-羥基丙醛對1,3-PDO的轉(zhuǎn)化。另一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，用粗甘油發(fā)酵時細胞干重增加，可能是由于粗甘油碳源中的有機物可以被微生物作為補充碳源，從而比純甘油發(fā)酵生產(chǎn)獲得更高的生物量[19]。最終結(jié)果表明，在2 L補料分批發(fā)酵工藝中，該重組菌培養(yǎng)72 h后P3HP積累占細胞干重的9.8%±0.4%。

Feng等[20]在K.pneumonia菌株中引入E.coli的丙酰輔酶A合成酶基因prpEEc(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曝氣條件在P3HP生產(chǎn)和細胞生長中起著至關(guān)重要的作用。在該課題組研究的工程代謝途徑中，以3-HP作為P3HP的前體。然而，在以改變振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為50、100、200 r/min的3種曝氣條件下，P3HP生產(chǎn)僅占3-HP生產(chǎn)的10%左右。最終在不含維生素B12及優(yōu)化曝氣的條件下，培養(yǎng)48 h后P3HP含量占細胞干重的12.7%。經(jīng)研究結(jié)果推測，從3-HP合成P3HP的轉(zhuǎn)化效率低很可能是由于丙酰輔酶A合成酶 (PrpE)的酶活較低造成的，同樣在構(gòu)建R.eutropha表達載體時也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[21]。另一方面，PrpE是丙酸分解代謝過程中將丙酸酯催化合成丙酰輔酶A的關(guān)鍵酶，與丙酸鹽相比，3-HP可能并不適合作為PrpE合成底物。通過修飾PrpE或使用如S.typhimurium[22]等不同菌株來源的其他PrpE等方法，可達到改善P3HP生產(chǎn)的目的。

通常，微生物合成的PHA聚合物的分子量和產(chǎn)量之間存在平衡[23]。PHA聚合物的分子量和產(chǎn)量通常由合成PHA的3個關(guān)鍵酶，即phaC編碼的聚合酶、phaA編碼的β-酮硫解酶和phaB編碼的NADPH依賴性的乙酰乙酰CoA還原酶合成的比例確定。換句話說，這3種基因的表達水平可能會導(dǎo)致PHA合成產(chǎn)量的差異。眾所周知，對于操縱子下游的基因，靠近啟動子的基因?qū)⒈桓叨缺磉_[24]。Hiroe等[25]探索了工程菌株E.coli中phaCAB操縱子基因序列對目的基因轉(zhuǎn)錄效率的影響。研究結(jié)果表明，操縱子中核酸序列的特異性位置和排序構(gòu)成了調(diào)節(jié)基因表達的有效方法，如改變啟動子或調(diào)整誘導(dǎo)物的濃度都能夠有效地控制重組菌株合成PHA聚合物的產(chǎn)率和分子量。在此基礎(chǔ)之上，Andree?en等[26]重新排列phaCAB操縱子基因序列來完成P3HP合成操縱子結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，即在磷酸丙糖異構(gòu)酶敲除突變體中，通過工程化碳源依賴性質(zhì)粒成癮體系來克服發(fā)酵期間質(zhì)粒丟失問題，從而達到提高聚酯產(chǎn)率。

在以甘油為底物生物合成3-HP的代謝途徑中，楊鵬等[27]發(fā)現(xiàn)了該途徑中存在還原力不平衡從而限制P3HP產(chǎn)量的問題。該課題組基于K.pneumonia的1,3-PDO氧化還原酶基因dhaTKp，在P3HP合成途徑中引入1,3-PDO的合成 (圖1)，用以平衡細菌體內(nèi)還原力。通過自殺性載體系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，將甘油脫水酶及其激活因子的合成基因整合到E.coli基因組中，能夠有效降低質(zhì)粒的丟失率，增強質(zhì)粒穩(wěn)定性。經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后，最終構(gòu)建的工程菌可以獲得2.7 g/L的P3HP和2.4 g/L的1,3-PDO，相比此前研究中1.54 g/L的P3HP搖瓶產(chǎn)量[28]，此代謝途徑合成P3HP產(chǎn)量有了近2倍的提高，且同時能夠獲得高附加值的副產(chǎn)物。

為穩(wěn)定P3HP生產(chǎn)，Gao等[29]構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的E.coli重組菌株，在氨基酸合成代謝基礎(chǔ)上，采用染色體基因整合和質(zhì)粒成癮系統(tǒng)技術(shù)，獲得高產(chǎn)P3HP的工程菌株E.coliQ1738。在有氧條件下，該重組菌株經(jīng)甘油發(fā)酵可獲得25.7 g/L的P3HP，細胞積累高達67.9%。此項研究表明，如果在相同菌株中存在兩種或更多種類型的質(zhì)粒，則質(zhì)粒穩(wěn)定性將降低，導(dǎo)致P3HP產(chǎn)量不高。據(jù)報道，在驗證質(zhì)粒的穩(wěn)定性實驗中，隨著質(zhì)粒長度的增加而穩(wěn)定性隨之降低，而質(zhì)粒重復(fù)數(shù)量的增加引起的代謝負荷是質(zhì)粒損失的主要原因[30-31]。由此推測，多重質(zhì)粒對細胞代謝負擔較重，單一質(zhì)粒更加合理穩(wěn)定。此外，在甘油途徑中經(jīng)由甘油脫水酶轉(zhuǎn)化生成的3-羥基丙醛具有的毒性作用也是降低P3HP產(chǎn)量的原因之一。

1.2 丙二酸單酰輔酶A途徑

丙二酸單酰輔酶A途徑，即脂肪酸從頭合成途徑。這一途徑可以利用各類碳源為底物，尤其是廉價、豐富的、可再生木質(zhì)纖維素類物質(zhì)都能通過細胞代謝生成乙酰輔酶A，從而進一步生成中間產(chǎn)物丙二酸單酰輔酶A以達到合成終產(chǎn)物P3HP的目的，該途徑是低成本合成P3HP的首選途徑[32]。

Fukui等[21]將乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶基因acc作用下轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A，并引入橙色綠屈撓菌Chloroflexus aurantiacus的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcrCa合成3-HP，再將丙酰輔酶A合成酶基因pcsCa轉(zhuǎn)入到R.eutropha合成P3HP，該項研究成功搭建了一條人工廉價合成P3HP的新通路 (圖1)。Wang等[12]為了提高該反應(yīng)體系中P3HP的合成效率，過表達E.coli的基因accABCDEc以提高胞內(nèi)丙二酸單酰輔酶A濃度，并同時以轉(zhuǎn)入E.coli的丙酰輔酶A合成酶基因prpEEc替換pcsCa基因，在E.coli中重新構(gòu)建P3HP合成通路。該重組E.coli以葡萄糖為碳源合成P3HP，其產(chǎn)量最高為13 mg/L，占細胞干重的0.98%。

丙二酸單酰輔酶A途徑中，以遺傳背景明確且易培養(yǎng)的E.coli為宿主菌進行P3HP合成時，雖能利用非結(jié)構(gòu)相關(guān)碳源但其產(chǎn)量明顯過低。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，P3HP產(chǎn)量低可能是由質(zhì)粒丟失引起的。首先，重組菌株中含有抗生素抗性的質(zhì)粒選擇性標記基因分泌于培養(yǎng)基中，可能造成相應(yīng)抗生素快速分解及無質(zhì)粒細胞過度生長；其次，在丙二酸單酰輔酶A還原酶 (MCR)催化兩步反應(yīng)中的中間產(chǎn)物丙二酸半醛及產(chǎn)物3-HP對E.coli的毒性作用，加重了質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。另一方面，低活性的MCR也是造成P3HP含量低的原因之一。來自光合作用的綠色非硫細菌的MCR作為微生物生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，其最佳酶活反應(yīng)溫度為57℃[32]，而載體E.coli的最適生長溫度為37℃，在37℃培養(yǎng)條件下MCR酶的活性僅能達到最大活性的60%，因此培養(yǎng)溫度成為制約MCR活性的一個因素。此外，MCR活性受其生理特性的嚴格控制。MCR在E.coli中表達時，由于生理環(huán)境的變化，導(dǎo)致MCR酶活性可能進一步降低。

為了解決MCR催化活性低的問題，學(xué)者們對MCR功能域進行了詳細分析。Liu等[33]認為，MCR酶分MCR-N(氨基酸1–549)和MCR-C(氨基酸550–1219)兩個活性中心，且催化丙二酸單酰CoA合成3HP分兩步：MCR-C先將丙二酸單酰CoA還原成游離的中間體丙二酸半醛，再由MCR-N將其催化為3HP(圖1)。Liu等[34]對該路徑中關(guān)鍵酶的活性分析后發(fā)現(xiàn)，MCR-C活性比MCR-N低4?5倍，即MCR酶活性不均衡限制下游產(chǎn)物高效積累。分別對MCR-C和MCR-N進行定向誘變來調(diào)控兩者的表達速率，同時優(yōu)化發(fā)酵條件，P3HP前體物3-HP的產(chǎn)量最高可達到40.6 g/L。

Yang等[35]認為丙二酸單酰輔酶A代謝不平衡限制下游產(chǎn)物合成，采用反義RNA技術(shù)下調(diào)丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸通路，并在E.coli中實現(xiàn)富集，當fabD基因表達被抑制時細胞內(nèi)丙二酸單酰輔酶A濃度增加4.5倍。Yuzawa等[36]在研究丙二酸單酰輔酶A經(jīng)過3-HP途徑積累聚酮化合物的過程中也發(fā)現(xiàn)，當胞內(nèi)提供充足丙二酸單酰輔酶A時，下游產(chǎn)物的合成能力提高100倍。進而Zhang等[37]提出設(shè)計丙二酸單酰輔酶A動態(tài)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以便提高丙二酸單酰輔酶A合成與轉(zhuǎn)化速率，從而提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量。

1.3 β-丙氨酸 (β-alanine)途徑

前期研究發(fā)現(xiàn)，在甘油途徑中，雖然能夠提高最終產(chǎn)物P3HP的產(chǎn)量，但維持甘油脫水酶的活性需要外源供應(yīng)維生素B12，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高；而丙二酸單酰輔酶A途徑中，以葡萄糖作為碳源合成P3HP，其產(chǎn)量偏低，不能夠有效應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。

為了解決上述問題，Wang等[38]在重組E.coli中開發(fā)了一種從廉價碳源出發(fā)由β-丙氨酸作為中間體合成P3HP的新途徑 (圖1)。經(jīng)過一系列系統(tǒng)優(yōu)化后，克隆E.coli的L-天冬氨酸脫羧酶基因panDEc及其成熟因子panMEc、3-羥基酸脫氫酶基因ydfG和丙酰輔酶A合成酶基因prpEEc，同時擴增P.putida的β-丙氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶基因pp0596以及R.eutropha的PHA聚合酶基因phaC1Re，并將上述全部基因在E.coli中表達。以甘油和葡萄糖為碳源，搖瓶培養(yǎng)重組菌株產(chǎn)生的P3HP含量為0.5 g/L，高達細胞干重的10.2%。雖然P3HP的含量不高，但該途徑比其他報道途徑的優(yōu)勢在于氧化還原中性，不需要添加任何輔酶及昂貴的前體，可以利用廣泛的碳源等，以上優(yōu)勢也值得科研工作者進一步研究與開發(fā)。

Lacmata等[39]在以β-丙氨酸為中間體的P3HP合成途徑中發(fā)現(xiàn)，由天冬氨酸生物合成途徑產(chǎn)生的L-天冬氨酸可利用E.coli的L-天冬氨酸-α-脫羧酶轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，中間產(chǎn)物β-丙氨酸由P.putida的β-丙氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化成丙二酸半醛，然后丙二酸半醛由3-羥基酸脫氫酶從E.coli還原為3-HP作為P3HP的前體 (圖1)。實驗過程發(fā)現(xiàn)，β-丙氨酸供應(yīng)不足限制了P3HP的生物合成，可能是由于L-天冬氨酸-α-脫羧酶活性低或胞內(nèi)L-天冬氨酸濃度不高所引起的。L-天冬氨酸-α-脫羧酶是β-丙氨酸通路中的限速酶，可通過轉(zhuǎn)入E.coli或谷氨酸棒桿Corynebacterium glutamicum的L-天冬氨酸-α-脫羧酶提高合成效率，以便生成足量的β-丙氨酸。但實驗結(jié)果顯示，L-天冬氨酸濃度的增高并未有效轉(zhuǎn)化合成β-丙氨酸。最終實驗表明，適宜條件下的重組E.coli分別在燒瓶培養(yǎng)和補料分批發(fā)酵中合成0.98 g/L和10.2 g/L P3HP。

圖1 P3HP生物合成途徑[40]Fig.1 P3HP biosynthetic pathway[40].Acc:acetyl-CoA carboxylase from E.coli;AcoE:acetyl-CoA synthase from R.eutropha;AldD:aldehyde dehydrogenase from P.putida;DhaB12:glycerol dehydratase from C.butyricum;DhaB123:glycerol dehydratase from K.pneumoniae;GdrAB:glycerol dehydration enzyme co-factor from K.pneumoniae;DhaT:1,3-propanediol oxidoreductase from P.putida or K.pneumonia;MCR:malonyl-coenzyme A(CoA)reductase from C.aurantiacus;MCR-C:malonyl-coenzyme A(CoA)reductase from C.aurantiacus;MCR-N:malonyl-coenzyme A(CoA)reductase from C.aurantiacus;OrfZ:coenzyme A(CoA)transferase from C.kluyveri;Pcs’:coenzyme A(CoA)ligase domain from C.aurantiacus;PctCp:propionyl-CoA transferasefrom C.propionicum;PduP:propionaldehyde dehydrogenase from S.typhimurium;PhaC1:PHA synthase from R.eutropha;PrpE:propionyl-CoA synthase from E.coli or S.typhimurium;ACS:3-hydroxypropinyl-CoA synthase from C.aurantiacus;YdfG:3-hydroxyacid dehydrogenase from E.coli;MmsB:3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase from P.putida;PanD:L-aspartate decarboxylase from E.coli;PP0596:b-alanine-pyruvate transaminase from P.putida;GabT:4-Aminobutyrate transaminase from C.acetobutylicum.

為了釋放胞內(nèi)聚羥基脂肪酸酯，提高最終產(chǎn)物產(chǎn)量，Lacmata等[41]同時建立了一種利用鎂嚴格控制的新型自溶系統(tǒng)，應(yīng)用于工程化E.coli中P3HP的生產(chǎn)。通過啟動子PmgtA后面的5′非翻譯區(qū) (5′UTR)插入到過表達的裂解基因 (E.coli的S、R和Rz)中構(gòu)建自溶系統(tǒng)。在含有裂解基因和P3HP生物合成基因的雙重質(zhì)粒的P3HP表達系統(tǒng)中，自溶系統(tǒng)功能良好 (裂解效率超過90%)，而P3HP生產(chǎn)由于質(zhì)粒損失而降低。將自溶基因和P3HP生物合成基因整合到一個質(zhì)粒中，在啟動子PmgtA-UTR的菌株Q2646中實現(xiàn)了P3HP含量為72.7%(比對照提高 2.4倍)及質(zhì)粒穩(wěn)定性為79.8%±3.1%。然而，在含有啟動子PmgtA的菌株Q2647中，由于細胞快速裂解而不能高效合成P3HP。在Mg2+剝離條件下活化的新型自溶體系證明了在聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)中應(yīng)用的可行性，其可能對其他胞內(nèi)產(chǎn)物的合成具有很大的應(yīng)用潛力。

2 結(jié)論與展望

本綜述旨在總結(jié)近年來P3HP生物合成的研究進展。近幾年，研究者通過基因工程技術(shù)構(gòu)建有效的P3HP生物合成途徑：其中，丙二酸單酰輔酶A途徑和甘油途徑經(jīng)過改造可以利用豐富而廉價的碳源，在一定程度上提高P3HP的合成效率；而新型的β-丙氨酸途徑經(jīng)過優(yōu)化也可以降低生產(chǎn)成本，目前也成為生物合成中的熱門話題。但迄今為止，P3HP生物合成技術(shù)依然存在以下問題：1)添加相關(guān)輔酶及P3HP結(jié)構(gòu)類似前體增加生產(chǎn)成本。2)基因工程菌株中的質(zhì)粒丟失致使最終P3HP產(chǎn)量偏低。3)在P3HP生物合成途徑中，相關(guān)中間產(chǎn)物濃度過高造成細胞毒性；部分酶活性低；氧化還原反應(yīng)不平衡。以上問題都尚待解決。

隨著基因編輯技術(shù)與表達修飾技術(shù)的成熟與發(fā)展，現(xiàn)逐步應(yīng)用在醫(yī)藥、化工等諸多領(lǐng)域，因而：1)正如Gao等[29]在2014年的報道中利用基因組整合技術(shù)有效增加了甘油途徑中P3HP的產(chǎn)量，可以將基因組的改造運用到丙二酸單酰輔酶A生產(chǎn)途徑中；2)可依據(jù)Zhang課題組研發(fā)的生物傳感器的負反饋調(diào)控機制[13]，尋找MCR酶活控制的關(guān)鍵因子，并設(shè)計負反饋調(diào)節(jié)通路，將MCR的酶活性與細胞增殖能力調(diào)控在較高水平上；3)利用基因敲除手段減少與終產(chǎn)物無關(guān)的代謝產(chǎn)物的生成，最終構(gòu)建出不需要額外添加輔酶及前體，通過丙二酸單酰輔酶A合成途徑，僅利用可再生、廉價碳源即可高效合成P3HP的穩(wěn)定遺傳背景的E.coli株系，推進廉價、大規(guī)模生產(chǎn)P3HP的工業(yè)化進程。

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