白詩夢，張芝晴，喬佳明，沈鴻霖，黃芳，高雙全，李少勇，李少偉,，夏寧邵,，顧穎,

1廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102

2廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點實驗室，福建 廈門 361102

人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 (HIV-1)gag基因所編碼的55 kDa蛋白是該病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白。所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的Gag蛋白包含N末端的膜結(jié)合MA(基質(zhì)蛋白)區(qū)域、CA(衣殼蛋白)以及臨近Gag蛋白C末端的RNA結(jié)合的核殼體 (NC)區(qū)域[1]。而衣殼蛋白 (CA)在HIV病毒的組裝和成熟過程中起著至關(guān)重要的作用[2]。

一個具有感染性的HIV病毒粒子的組裝是分為兩個階段進(jìn)行的[3]。首先Gag蛋白在質(zhì)膜表面發(fā)生寡聚化，隨后與膜分離釋放出一個非成熟形式的非感染性的顆粒。在組裝的第二個階段，蛋白酶被激活后，水解Gag前體蛋白為各個成熟的結(jié)構(gòu)蛋白。酶切導(dǎo)致病毒顆粒內(nèi)部發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，從而使病毒粒子從非成熟形式重組為成熟的具有感染性的顆粒。其中蛋白酶水解導(dǎo)致的病毒顆粒的成熟是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的一個重要靶點[4]。因此非成熟病毒顆粒的形成是HIV-1組裝的一個關(guān)鍵階段。

目前，人們對HIV病毒的整體結(jié)構(gòu)有了清晰的認(rèn)識，并且隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，近年來對成熟的HIV-1病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了大量高分辨的結(jié)構(gòu)解析，但對非成熟病毒顆粒結(jié)構(gòu)了解較少。病毒顆粒的組裝和感染性粒子的形成是一個十分復(fù)雜的過程，弄清這一過程，有助于抗病毒藥物及疫苗的研制[4-6]，可以為人類提供一個研究預(yù)防和治療HIV感染的新途徑。相關(guān)研究借助純化后重組的部分Gag蛋白——CAP2NC蛋白模擬非成熟病毒顆粒體外自組裝系統(tǒng)[7-9]，用來探索逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期中發(fā)生的形態(tài)變化[10]。

本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到大量可溶的CAP2NC蛋白，并對表達(dá)的CAP2NC蛋白反應(yīng)活性、體外組裝特性等進(jìn)行分析，探索其體外自組裝條件，為進(jìn)一步解析該蛋白結(jié)構(gòu)并深入研究非成熟病毒樣顆粒提供了原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

E.coliBL21(DE3)菌株由本實驗室保存；NL4-3質(zhì)粒及克隆表達(dá)載體pTO-T7質(zhì)粒為本實驗室保存[11]；單抗A10F9、13E11、12G4均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

DNA marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟PMSF蛋白酶抑制劑為上海碧云天公司產(chǎn)品；Super Signal Western化學(xué)發(fā)光底物為PIERCE公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；MES購自SIGMA-ALDRICH；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗由本實驗室生產(chǎn)；Phenyl agarose Fast Flow疏水層析介質(zhì)填料購自美國GE healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) HIV-1 NL4-3 CAP2NC基因序列設(shè)計一對特異性引物，上游引物：5′-TAACTTAAGAAGG AGATATACATATGCCTATAGTGCAGAACCTCC AG-3′和下游引物：5′-GTGGTGGCTCGAGGCGG CCGCAAGCTTATTAGCCTGTCTCTCAGTACAA T-3′(下劃線為NdeⅠ和HindⅢ酶切位點)，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。以NL4-3質(zhì)粒為模板，用合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并按照DNA凝膠電泳回收試劑盒說明書操作，切膠回收目的基因片段。用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切pTO-T7載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收并純化后用本實驗構(gòu)建的Gibsen裝配液進(jìn)行載體與目的片段的連接，構(gòu)建pTO-T7-CAP2NC表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個陽性克隆，PCR擴(kuò)增鑒定重組質(zhì)粒，并由本實驗室內(nèi)部進(jìn)行測序驗證其正確性。

1.2.2 CAP2NC蛋白理化性質(zhì)分析

利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng) (Expert Protein Analysis System，ExPASy)提供的生物信息學(xué)工具Protparam，分析預(yù)測蛋白質(zhì)的氨基酸殘基性質(zhì)、分子量、親水性強弱及理論等電點。

1.2.3 CAP2NC蛋白的純化與鑒定

將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆接種于LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%接種到相同的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.9時，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)4 h后，7000×g離心10 min收集菌體。菌體沉淀重懸于破菌緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，10 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，10%(V/V)甘油，pH 8.0)，在冰浴下超聲破菌。破菌液4℃、25000×g離心20 min，收集上清部分。

離心后的上清加0.5%(V/V)飽和硫銨后進(jìn)樣至以5倍柱體積的A液 (50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，10 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，10%(V/V)飽和硫銨，pH 8.0)平衡的Phenyl-Sepharose FF疏水層析柱，2 mL/min流速上樣，用B液 (20 mmol/LMes(pH 6.0)，20 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF)進(jìn)行階段洗脫，分段收集目的峰。進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡鑒定 (一抗為 A10F9[12])。

1.2.4 CAP2NC蛋白與抗p24抗體結(jié)合反應(yīng)活性的檢測

以純化的CAP2NC蛋白包被96孔ELISA板，100 ng/孔，以1×CB(pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)作為稀釋液，4℃過夜。以5%的脫脂牛奶37℃封閉 2 h，180 μL/孔。抗 p24 mAb 用樣品稀釋液 (含蔗糖，酪蛋白，小牛血清等)稀釋到100 ng/mL，按照2倍比從高到底進(jìn)行梯度稀釋，共12個梯度，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，以TBST洗5遍，加入1∶5000稀釋的羊抗鼠二抗 GAM-HRP。37℃反應(yīng)30 min后，TBST洗5遍，甩干后以1∶1加入TMB底物顯色液A液和B液，100 μL/孔，37℃反應(yīng)10 min。加終止液 (2 mol/L H2SO4)終止反應(yīng)，50 μL/孔，測定波長為 450–630 nm 的吸光值。

1.2.5 CAP2NC蛋白體外組裝特性分析

為監(jiān)測目的蛋白的組裝特性，首先通過顆粒分析實驗，將純化后的不同濃度的目的蛋白透析到50 mmol/L TB 8.0+0.1 mol/L NaCl緩沖液中，并且在透析之前于樣品中加入一定濃度 (W/W)的Yeast-RNA，于室溫下透析16 h后，將樣品進(jìn)行高速離心 (13000×g，30 min)。將組裝的顆粒樣品與未組裝的分離，分別取上清和沉淀進(jìn)行非還原性和還原性SDS-PAGE，考染后觀察蛋白體外自組裝情況[13]。

1.2.6 凝膠過濾層析分析

根據(jù)透析后的蛋白樣品非還原SDS-PAGE結(jié)果，選取可以自組裝的蛋白樣品進(jìn)行分子篩排阻層析分析：利用TSK-Gel PW5000(8 mm×300 mm)層析柱，以0.5 mL/min的流速將待測樣品通過層析介質(zhì)，并記錄樣品中各組分的吸收峰情況。

1.2.7 透射電子顯微鏡觀察

將0.1 mg/mL透析后的蛋白樣品吸附于鍍炭的銅網(wǎng)上10 min，用濾紙從邊緣小心吸去樣品殘液，再將樣品用2%磷鎢酸溶液 (pH 7.0)負(fù)染15 min，再次吸去殘液，在白熾燈下照射待其完全干燥。使用Tecnai G2 Spirit透射電鏡 (美國FEI公司)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將經(jīng)PCR擴(kuò)增純化回收后的目的片段連接NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后的pTO-T7載體，構(gòu)建CAP2NC重組質(zhì)粒pTO-T7-CAP2NC，將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒用于后續(xù)純化實驗。

2.2 CAP2NC蛋白的純化與鑒定

利用ProtParam工具預(yù)測表明CAP2NC蛋白理論等電點 (pI值)9.09，親水性平均系數(shù) (GRAVY)為–0.507。根據(jù)該蛋白的總親水性系數(shù)得出該蛋白親水性較弱，初步推測可以使用疏水層析進(jìn)行純化。并且純化緩沖液的pH值需低于理論pI值，初步將其定在6.0–8.0，然后根據(jù)不同試劑的緩沖能力選擇相應(yīng)的緩沖液。

菌體沉淀經(jīng)緩沖液重懸并超聲裂解后，裂解上清通過苯基疏水柱純化得到了重組的CAP2NC蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting鑒定。由圖1A可見，在33 kDa左右處有一條與理論值相符的目的條帶。超聲上清經(jīng)Phenyl-HP疏水層析階段洗脫后，獲得不同濃度的洗脫峰，經(jīng)10%SDS-PAGE分析可看出，泳道2穿透液中只有少量目的蛋白未掛柱，目的蛋白和與之大小相近的雜蛋白都得到有效分離，且雜蛋白較少，經(jīng)軟件掃描蛋白純度達(dá)到95%以上。Western blotting結(jié)果表明 (圖1B)，最終純化產(chǎn)物為CAP2NC蛋白，并且與抗p24單抗有較好的反應(yīng)性。

2.3 CAP2NC蛋白與抗p24抗體結(jié)合反應(yīng)活性的檢測

純化后的CAP2NC蛋白與抗p24的3種單抗A10F9、13E11、12G4進(jìn)一步通過酶聯(lián)免疫吸附實驗 (ELISA)檢測其反應(yīng)活性，結(jié)果如圖2所示?？梢钥吹?5%B洗脫時收集的目的蛋白與不同抗體有較好反應(yīng)活性，這與Western blotting(圖1B)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明通過疏水柱層析純化后的目的蛋白具有活性。

2.4 CAP2NC蛋白體外組裝特性分析

圖1 CAP2NC蛋白的分離純化及鑒定Fig.1 Purification and identification of CAP2NC.(A)Purification through phenyl-HP column.M:protein marker;1:broken bacterial supernatant total protein;2:over phenyl-HP agarose column flowthrough post;3:75%B elution fraction;4:100%B elution component;5:ultrapure water elution component.(B)Western blotting identification of the purified CAP2NC;1–5:each band is corresponding to the figure A.

圖2 CAP2NC反應(yīng)活性檢測Fig.2 Identification the reactivity of CAP2NC.

用顆粒分析實驗檢測CAP2NC蛋白的體外自組裝特性，純化后的不同洗脫成分的CAP2NC蛋白經(jīng)3倍濃縮后透析到50 mmol/L TB 8.0+0.1 mol/L NaCl緩沖液，并且在透析之前于樣品中加入10%(W/W)的Yeast-RNA(本實驗還嘗試了1%、5%的質(zhì)量百分比，方法相同)，室溫下透析16 h，樣品經(jīng)高速離心后，取上清和沉淀進(jìn)行10%非還原性SDS-PAGE分析。如圖3A所示，大部分蛋白透析后經(jīng)離心后均在沉淀中，并且在沉淀中 (泳道1、3、5)可看到二聚體、五聚體以及多聚體，而上清中只有少量單體蛋白 (泳道2、4、6)，說明CAP2NC蛋白在體外可以自組裝。取75%B洗脫的目的蛋白透析后的樣品，分別進(jìn)行10%的還原性和非還原性SDS-PAGE分析，在蛋白形成聚體過程中，分子間作用力或二硫鍵均會起到比較重要的作用，而從圖3B可看出，無論是否經(jīng)過還原處理，CAP2NC蛋白透析后均有多聚體形成，這進(jìn)一步表明該蛋白的體外自組裝不是源于二硫鍵的作用，推測在特定的緩沖液中CAP2NC蛋白形成聚體主要是因RNA的加入來驅(qū)動不同蛋白分子間的相互作用導(dǎo)致的。

2.5 CAP2NC蛋白自組裝后凝膠過濾層析分析

圖3 SDS-PAGE檢測CAP2NC蛋白體外自組裝特性Fig.3 Monitoring the self-assembly properties of the CAP2NC proteins in vitro.(A)Employing pelleting assays to investigate the assembly properties.M:protein marker;After dialysis,75% B elution fraction was centrifuged to separate the pellet(1)and supernatant(2)fractions, both components were subjected to non-reducing SDS-PAGE gels;3:the pellet of 100%B elution component;4:the supernatant of 100%B elution component;5:the pellet of ultrapure water elution constituent;6:the supernatant of ultrapure water elution constituent.(B)Identification of the assembly properties of 75%B elution component.M:protein marker;1,2:reducing;3,4:non-reducing.

以75%B洗脫純化的CAP2NC蛋白在50 mmol/L TB 8.0+0.1 mol/L NaCl緩沖液中透析，12000×g高速離心10 min后，取上清通過凝膠層析柱 (G5000)分析蛋白透析后組裝情況，結(jié)果如圖4所示。圖4A為凝膠過濾層析蛋白標(biāo)準(zhǔn)品G5000分子篩圖譜。根據(jù)不同大小的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 (美國GE healthcare公司)峰保留時間推測CAP2NC蛋白透析后各組分中聚體及顆粒形成情況。其中440 kDa蛋白標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時間為17.3 min，75 kDa蛋白標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時間為21.5 min，30 kDa蛋白標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時間22.9 min。圖4B為透析前加入1%或5%Yeast-RNA的樣品出峰圖譜，大部分樣品峰保留時間在14.8 min，小部分為11.5 min。由于CAP2NC蛋白單體大小理論值為33 kDa，推測該蛋白透析后形成了不同大小的顆?；蛘呔垠w，分子量大于440 kDa。而圖4C為透析前加入10%Yeast-RNA的樣品出峰圖譜，較多樣品峰保留時間在11.7 min，少量為21.3 min和22.6 min，推測較多的樣品在加入10%RNA透析后形成了顆粒，只有較少部分蛋白以二聚體或單體形式存在。

2.6 CAP2NC蛋白自組裝后電鏡觀察

取凝膠過濾層析鑒定后的樣品進(jìn)行負(fù)染，通過電鏡進(jìn)一步觀察顆粒形態(tài)。結(jié)果如圖5A顯示，經(jīng)染色后，若透析之前樣品中加入1%或者5%的Yeast-RNA，電鏡下既可看到與野生型CA體外自組裝后形成的形態(tài)相似的空心管狀的顆粒[14]，又可觀察到空心的顆粒樣或者圓形薄片狀結(jié)構(gòu)；若透析前樣品中加入10%RNA，觀察到大部分CAP2NC蛋白組裝為空心管狀顆粒，長短大小不一 (圖5B)。推測透析前樣品中由于RNA的加入，在很大程度上驅(qū)動了CAP2NC蛋白的多聚化，并且在其形成顆粒的過程中有各種各樣的結(jié)構(gòu)，并且空心的顆粒樣或者圓形薄片狀結(jié)構(gòu)或許是組裝過程中的一種中間形態(tài)。

3 討論

HIV的高變異性使其對藥物的耐受性日趨嚴(yán)重，抗艾滋藥物本身也具有較強的毒副作用，那么尋找新的藥物作用靶點成為了抗HIV感染研究的核心[15]。而HIV病毒生活周期的每一個階段都可以作為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物研發(fā)的一個重要靶點[4-6]。目前有報道利用X線斷層成像技術(shù)及電鏡技術(shù)精確揭示了未成熟HIV的CA-SP1的3D信息，并從結(jié)構(gòu)水平上檢測一種新型藥物抑制HIV病毒的成熟過程，為深入揭示HIV對藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制及后期開發(fā)改造靶向HIV的新型藥物提供研究線索和思路[16]。未成熟的病毒顆粒作為HIV組裝過程中的一個關(guān)鍵產(chǎn)物，對于揭示介導(dǎo)非成熟病毒組裝的蛋白質(zhì)界面和結(jié)構(gòu)變化是很重要的。而這種變化需要進(jìn)一步運用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法比較研究。CAP2NC蛋白作為Gag蛋白的一部分，本身能夠裝配為非成熟的管狀結(jié)構(gòu)。本研究對該蛋白純化優(yōu)化后鑒定了其具有體外自組裝的性質(zhì)。

圖4 CAP2NC蛋白組裝后高效液相色譜儀分析Fig.4 Analysis of self-assembly CAP2NC by HPSEC.(A)G5000 molecular sieve map of 440 kDa protein standard.(B)CAP2NC sample G5000 molecular sieve map with addition of 1%or 5%yeast-RNA prior to dialysis.(C)CAP2NC sample G5000 molecular sieve map with addition of 10%yeast-RNA before dialysis.

圖5 CAP2NC蛋白自組裝為顆粒后電鏡觀察Fig.5 Observation of the morphology of self-assembly CAP2NC by transmission electron microscopy.(A)The morphology of self-assembly CAP2NC with addition of 1% or5% yeast-RNA priortodialysis.(B)The morphology of self-assembly CAP2NC with addition of 10%yeast-RNA before dialysis.

在分析CAP2NC蛋白體外組裝條件的過程中，本研究通過建立該蛋白體外組裝體系，首先通過顆粒分析實驗鑒定了該蛋白可自組裝。接下來通過分子篩分析發(fā)現(xiàn)樣品中加入1%或5%RNA，在 50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)、100 mmol/L NaCl溶液條件下，根據(jù)峰保留時間分析一部分蛋白形成顆粒，有較多多聚體存在。進(jìn)一步通過電鏡驗證，既可觀察到不同長度的管狀顆粒，也可觀察到空心的顆粒樣或片狀結(jié)構(gòu)；而樣品中加入10%RNA，相同的緩沖條件下推測大部分蛋白形成顆粒，只有少部分蛋白為二聚體或單體形式存在，電鏡下觀察時只有管狀結(jié)構(gòu)形成，并且室溫下放置一段時間后，仍有顆粒存在。出現(xiàn)這種差異的原因可能是RNA與蛋白的結(jié)合存在一個飽和度[2,17-18]。推測CAP2NC蛋白體外組裝加入RNA后，RNA作為支架，通過與NC的相互作用，誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象發(fā)生變化 (類似于核糖核蛋白鏈)，從而促進(jìn)非成熟顆粒的組裝，空心圓柱形管狀結(jié)構(gòu)的形成。該推論還需進(jìn)一步結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的驗證。本研究通過分析CAP2NC蛋白理化性質(zhì)并確定以10%RNA加入量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗，進(jìn)一步增加病毒衣殼體外的穩(wěn)定性，為接下來對該蛋白的空間結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)，同時也為HIV非成熟病毒顆粒結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究提供了參考。

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