王凈，呂瑞辰，韓延平，楊瑞馥

1河北北方學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 張家口 075131

2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的新型分子生物學(xué)技術(shù)，常用的Red系統(tǒng)重組方法是通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組[1-4]，即用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，使機(jī)體特定的基因缺失，從而達(dá)到基因敲除的目的[5-6]，這種方法具有專一性強(qiáng)、染色體DNA與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)[7-8]。通過(guò)抗性篩選完成的基因敲除，基因組留存一定的抗性基因片段，影響了后續(xù)研究工作?？剐曰騼蓚?cè)含有2個(gè)同向的FRT位點(diǎn)，研究者通常利用FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)刪除抗性基因，該系統(tǒng)的FLP重組酶 (Flippase recombination enzyme)可以介導(dǎo)FRT位點(diǎn) (FLP recombination target)之間的基因發(fā)生刪除重組。即使這樣，在重組分子上仍殘留2個(gè)48 bp的FRT序列，達(dá)不到無(wú)痕敲除的目的[9]。

目前，無(wú)痕敲除技術(shù)主要有單質(zhì)粒敲除法[10]、兩步同源重組正負(fù)篩選法[11]、Tn5靶向的Cre/loxP切除系統(tǒng)法[12]等，這些方法操作復(fù)雜、轉(zhuǎn)化效率低、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法將λ-Red系統(tǒng)與Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶相結(jié)合[13-14]，通過(guò)兩步Red基因重組即可實(shí)現(xiàn)[15]，首先進(jìn)行第一次同源重組，將兩端帶有Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶的抗性基因片段替換目的基因[16]，然后在輔助質(zhì)粒的參與下，通過(guò)誘導(dǎo)激活Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶，暴露替換基因，具有同源的基因片段發(fā)生第二次重組，從而刪除抗性基因[17]，輔助質(zhì)粒被Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶切成片段而失活，最后經(jīng)抗性篩選得到重組菌株[18-19]。第一步重組技術(shù)非常成熟，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域[20-24]，第二步操作簡(jiǎn)單易行，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)90%。雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法是無(wú)痕敲除方法中的最優(yōu)選擇，以其快速的優(yōu)點(diǎn)將無(wú)痕敲除技術(shù)推到了更高的層次。

雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法多用于基因定點(diǎn)插入、點(diǎn)突變的研究，對(duì)于長(zhǎng)片段的基因敲除未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法，以大腸桿菌K-12 MG1655基因組hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)基因?yàn)槟Ｐ?，通過(guò)融合PCR方法分別構(gòu)建缺失hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)的融合片段并連接至輔助質(zhì)粒，通過(guò)同源重組完成高效無(wú)痕敲除技術(shù)，為大片段的無(wú)痕敲除技術(shù)提供理論依據(jù)和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

pREDTKI、pKSI-1、pMDISI三種質(zhì)粒 (圖1)由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊晟研究員贈(zèng)送，大腸桿菌Escherichia coliK-12 MG1655為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所王恒樑老師贈(zèng)送。

1.2 引物設(shè)計(jì)

結(jié)合雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法 (圖2)和融合PCR方法，根據(jù)構(gòu)建無(wú)痕敲除基因的原理，設(shè)計(jì)hfq和rne-710基因擴(kuò)增引物和鑒定引物 (表1)。

1.3 質(zhì)粒提取

按照QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)操作步驟提取pREDTKI、pKSI-1和pMDISI質(zhì)粒。

1.4 pREDTKI質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至E.coli K-12 MG1655感受態(tài)細(xì)胞

取過(guò)夜活化的E.coliK-12 MG1655菌液轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為1.0左右離心收集菌體；預(yù)冷的10%甘油洗滌菌體并以100 μL重懸，加入1 μL pREDTKI進(jìn)行質(zhì)粒電擊，菌液30℃搖床復(fù)蘇1 h，取50 μL涂布含有卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)，12–16 h后挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并保種，用TKI-Kan-F/TKI-Kan-R引物鑒定pREDTKI質(zhì)粒。

1.5 λ-Red重組

1.5.1 PCR擴(kuò)增壯觀霉素抗性盒

NanoDrop 2000測(cè)定提取的pMDISI質(zhì)粒濃度，再用去離子水稀釋成5 ng/μL作為模板。50μL PCR 體系：10×Ex Taq緩沖液 5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL ， Forward primer(10 μmol/L)1 μL，Reverse primer(10 μmol/L)1 μL，Ex Taq聚合酶0.4μL，Pfu聚合酶0.1μL，pMDISI質(zhì)粒(5 ng/μL)8μL，滅菌雙蒸水30.5μL，共擴(kuò)增10個(gè)體系。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，58℃ 40s，72℃ 2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)純化回收PCR產(chǎn)物。

1.5.2 DpnⅠ酶消化甲基化的模板質(zhì)粒

100μL酶切體系：PCR產(chǎn)物30μL，DpnⅠEnzyme 5 μL，10×NE 緩沖液 10 μL，滅菌雙蒸水 55μL。37℃酶切 4 h。酶切產(chǎn)物使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)膠回收壯觀霉素抗性盒。

1.5.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化

取活化菌K12 MG1655/pREDTKI擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.8左右，培養(yǎng)時(shí)加入L-阿拉伯糖至終濃度10 mmol/L、卡那霉素至終濃度50μg/mL，離心收集菌體并用冰冷的10%甘油洗滌，100 μL 10%甘油重懸后加入10 μL高濃度的壯觀霉素抗性盒，預(yù)冷20 min后進(jìn)行電擊，加入液體培養(yǎng)基復(fù)蘇，取離心后重懸菌體200 μL涂含卡那霉素、壯觀霉素的LB固體平板，挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并保種，將壯觀抗性盒敲入的菌株記為Δhfq∷Spe(壯觀霉素 Spectinomycin) 和Δrne∷Spe；分別用Hfq-I-F/Hfq-Spe-I-R、Hfq-Spe-I-F/Hfq-I-R、Hfq-F/Hfq-R、Hfq-I-F/Hfq-I-R引物和Rne-I-F/Rne-Spe-I-R、Rne-Spe-I-F/Rne-I-R、Rne-F/Rne-R、Rne-I-F/Rne-I-R引物鑒定重組菌。

圖1 質(zhì)粒圖譜[18](A：pREDTKI質(zhì)粒具有araB promoter，當(dāng)加入L-阿拉伯糖時(shí)可誘導(dǎo)λ-Red重組功能，pREDTKI質(zhì)粒同時(shí)具有trc promoter，當(dāng)加入IPTG時(shí)可誘導(dǎo)Ⅰ-SceⅠ酶表達(dá)；B：pKSI-1載體具有一個(gè)多克隆位點(diǎn)，含有兩個(gè)Ⅰ-SceⅠ識(shí)別位點(diǎn)；C：pMDISI質(zhì)粒具有壯觀抗性基因，兩側(cè)有FRT和Ⅰ-SceⅠ識(shí)別位點(diǎn))Fig.1 Plasmids profiles[18].(A)pREDTKI with arabinose-inducible(araB promoter)λ-Red recombinase functions and IPTG-inducible(trc promoter)Ⅰ-SceⅠexpression.(B)pKSI-1 vector with an MCS and twoⅠ-SceⅠrecognition sites.(C)Part of plasmid pMDISI with the spectinomycin resistance gene flanked by FRT sites andⅠ-SceⅠrecognition sites.

1.6 融合PCR

在hfq上下游和rne-710上下游600 bp左右設(shè)計(jì)引物對(duì)，待融合片段上下游引入SacⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。分別以 Hfq-F-1/Hfq-R-1、Hfq-F-2/Hfq-R-2、Rne-F-1/Rne-R-1、Rne-F-2/Rne-R-2共4對(duì)引物，k-12 MG1655菌株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以上述PCR產(chǎn)物為模板，分別用引物對(duì)Hfq-F-1/Hfq-R-2和Rne-F-1/Rne-R-2進(jìn)行擴(kuò)增，得到缺失hfq和rne-710基因的上下游融合片段。PCR體系和擴(kuò)增條件同1.5.1，將Ex Taq替換為高保真LATaq聚合酶，膠回收目的片段。按照常規(guī)操作分別酶切融合片段和pKSI-1質(zhì)粒，PCR回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，再將回收的片段與載體分別連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，引物對(duì)Hfq-F-1/Hfq-R-2和Rne-F-1/Rne-R-2進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的細(xì)菌培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒。pKSI-1-Δhfq和 pKSI-1-Δrne-710質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至Δhfq∷Spe和Δrne-710∷Spe，方法同上，引物對(duì)Hfq-F-1/Hfq-R-2和 Rne-F-1/Rne-R-2進(jìn)行菌落PCR鑒定。

圖2 雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法原理圖[18]Fig.2 Diagram of the two-plasmid scarless genetic modification method[18].

表1 本研究中使用的寡核苷酸引物Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

1.7 誘導(dǎo)重組

過(guò)夜培養(yǎng)K-12 MG1655/pKSI-1-Δhfq/pREDTKI和 K-12 MG1655/pKSI-1-Δrne/pREDTKI兩種菌液，添加卡那霉素、氨芐青霉素和壯觀霉素至常規(guī)濃度，5%葡萄糖至終濃度0.5%。接種50 μL上述菌液至5 mL LB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素、L-阿拉伯糖和5%葡萄糖，30℃振蕩培養(yǎng)6 h至OD600達(dá)到0.5左右，加入終濃度為20 mmol/L的IPTG培養(yǎng)過(guò)夜；取過(guò)夜菌轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入卡那霉素、L-阿拉伯糖、5%葡萄糖和IPTG，30℃振蕩培養(yǎng)6 h至菌液OD600為0.5左右。

取50 μL菌液用PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100、10–1、10–2稀釋液各 100 μL 分別涂平板 A(Kanr、10 mmol/L阿拉伯糖、20 mmol/L IPTG)和平板B(Kanr、10 mmol/L阿拉伯糖、20 mmol/L IPTG、Sper)，培養(yǎng)后挑取平板A單個(gè)菌落分別涂平板A和平板B，選擇平板A生長(zhǎng)而平板B不生長(zhǎng)的菌落，引物對(duì)Hfq-QC-F/Hfq-QC-R、Hfq-I-F/Hfq-I-R、Hfq-F/Hfq-R和 Rne-QC-F/Rne-QC-R、Rne-I-F/Rne-I-R、Rne-F/Rne-R分別進(jìn)行PCR鑒定。

1.8 pREDTKI質(zhì)粒的消除

將鑒定正確的菌液轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基，42℃、80 r/min培養(yǎng)2 h；取少量菌液10倍梯度稀釋后分別涂LB板 (Kanr)和無(wú)抗性LB板，37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)；選擇陰性板生長(zhǎng)而抗性板不生長(zhǎng)的單克隆，分純?nèi)⑦M(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建Δhfq∷Spe敲除株

pREDTKI質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至E.coliK-12 MG1655感受態(tài)細(xì)胞，然后使用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增壯觀霉素抗性盒，PCR產(chǎn)物純化回收后經(jīng)DpnⅠ酶消化質(zhì)粒模板，再通過(guò)膠回收得到壯觀霉素抗性盒，使用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)Red重組酶，制備E.coliK-12 MG1655/pREDTKI感受態(tài)細(xì)胞，將純化的壯觀霉素抗性盒電轉(zhuǎn)化至具有Red重組系統(tǒng)的感受態(tài)細(xì)胞中，染色體上的hfq基因經(jīng)同源重組被壯觀霉素抗性盒替代，從而實(shí)現(xiàn)λ-Red重組。通過(guò)hfq內(nèi)引物、外引物以及外引物同壯觀霉素抗性盒鑒定引物交叉配對(duì)共4對(duì)引物鑒定敲除株的正確性。結(jié)果可見(jiàn)，內(nèi)部引物野生株有235 bp大小的條帶，敲除株沒(méi)有條帶；外部引物敲除株有2002 bp大小的條帶；第一對(duì)交叉引物敲除株有242 bp大小的條帶；第二對(duì)交叉引物敲除株有537 bp大小的條帶，以上結(jié)果均與預(yù)期一致 (圖3)。內(nèi)部引物鑒定說(shuō)明敲除株基因組已經(jīng)不含有hfq基因，外部引物顯示分子量較大的條帶表明基因組已經(jīng)含有壯觀霉素抗性盒，交叉引物的鑒定說(shuō)明敲除株同源替換部位準(zhǔn)確。以上結(jié)果表明Δhfq∷Spe敲除株構(gòu)建成功。

2.2 構(gòu)建Δrne-710∷Spe敲除株

圖3 Δhfq∷Spe敲除株的鑒定Fig.3 Identification of Δhfq∷Spe.M:DL 5000 DNA marker.1–3:Hfq-F/Hfq-R.1:WT;2:Δhfq;3:negative control.4,5:Hfq-I-F/Hfq-I-R.4:Δhfq;5:negative control.6,7:Hfq-Spe-I-F/Hfq-I-R.6:Δhfq;7:negative control.8,9:Hfq-I-F/Hfq-Spe-I-R.8:Δhfq;9:negative control.

經(jīng)過(guò)λ-Red重組，壯觀霉素抗性盒取代rne-710基因。生長(zhǎng)的單克隆中大部分為雜菌，只有少量是敲除株，需要使用引物進(jìn)行PCR鑒定，使用外引物同壯觀霉素抗性盒引物交叉配對(duì)、內(nèi)引物、外引物全面鑒定敲除株。第一對(duì)交叉引物敲除株有510 bp大小的條帶，第二對(duì)交叉引物敲除株有620 bp大小的條帶，交叉引物的鑒定說(shuō)明壯觀霉素抗性盒有小部分存在基因組中，敲除株同源替換部位準(zhǔn)確；外部引物敲除株有2054 bp大小的條帶，比rne-710分子量大，包含了壯觀霉素抗性盒的全部堿基；內(nèi)部引物敲除株沒(méi)有條帶，野生株有490 bp大小的條帶，表明敲除株基因組不含rne-710基因。所有條帶的大小與預(yù)期結(jié)果一致 (圖4)，表明Δrne-710∷Spe敲除株構(gòu)建成功。

2.3 輔助質(zhì)粒pKSI-1-Δhfq的構(gòu)建

通過(guò)融合PCR的方法缺失目的基因片段，設(shè)計(jì)引物時(shí)保證上游的下游引物和下游的上游引物有15–20個(gè)重復(fù)堿基。首先PCR擴(kuò)增分體片段594 bp和619 bp，再用上游的上游引物和下游的下游引物擴(kuò)增融合片段，膠回收后同載體分別雙酶切并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建pKSI-1-Δhfq，PCR鑒定可見(jiàn)與預(yù)期一致的1195 bp大小的條帶 (圖5)。

2.4 輔助質(zhì)粒pKSI-1-Δrne-710的構(gòu)建

圖4 Δrne∷Spe敲除株的鑒定Fig.4 Identification of Δrne-710∷Spe.M:DL 5000 DNA marker.1,2:Rne-I-F/Rne-spe-I-R.1:negative control; 2: Δrne-710. 3,4: Rne-spe-I-F/Rne-I-R.3:negative control;4:Δrne-710.5,6:Rne-I-F/Rne-I-R.5:negative control;6: Δrne-710.7–9:Rne-F/Rne-R.7:negative control;8:Δrne-710;9:WT.

首先采用融合PCR的方法擴(kuò)增缺失rne-710片段，再與pKSI-1連接。在缺失rne-710片段的上下游設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增593 bp和563 bp大小的片段，再進(jìn)行第二輪擴(kuò)增融合片段，膠回收純化PCR產(chǎn)物，同載體分別雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，條帶的大小為1156 bp(圖 6)，表明 pKSI-1-Δrne-710構(gòu)建成功。

2.5 無(wú)痕敲除Δhfq的構(gòu)建

圖 5 pKSI-1-Δhfq的鑒定Fig.5 Identification of pKSI-1-Δhfq.M:DL 2000 DNA marker;1:negative control;2:pKSI-1-Δhfq.

圖 6 pKSI-1-Δrne-710的鑒定Fig.6 Identification of pKSI-1-Δrne-710.M:DL 2000 DNA marker;1:negative control;2:pKSI-1-Δrne-710.

Δhfq∷Spe菌株含有 pKSI-1-Δhfq和 pREDTKI質(zhì)粒。加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，使pREDTKI分泌Ⅰ-SceⅠ酶，將含有Ⅰ-SceⅠ酶切位點(diǎn)的壯觀霉素和pKSI-1載體酶切，L-阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下，pREDTKI質(zhì)粒發(fā)揮λ-Red重組功能，使得酶切后的線性融合片段替代壯觀霉素抗性盒，再通過(guò)卡那霉素抗性篩選，得到含有pREDTKI質(zhì)粒的無(wú)痕敲除菌株Δhfq。通過(guò)鑒定引物進(jìn)行驗(yàn)證敲除株，外部引物敲除株有499 bp大小的條帶，野生株有808 bp大小的條帶，敲除株條帶小于野生株，證明基因有缺失；內(nèi)部引物敲除株沒(méi)有條帶，野生株有235 bp大小的條帶，說(shuō)明該片段在敲除株中已經(jīng)不存在；在融合基因外部設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物進(jìn)行鑒定，敲除株有1678 bp大小的條帶，野生株有1987 bp大小的條帶，敲除株與野生株大小不同。以上結(jié)果與預(yù)期的大小一致 (圖7)，表明無(wú)痕敲除Δhfq構(gòu)建成功。

2.6 無(wú)痕敲除Δrne-710的構(gòu)建

圖7 Δhfq敲除株的鑒定Fig.7 Identification of Δhfq.M:DL 2000 DNA marker.1–3:Hfq-I-F/Hfq-I-R.1:negative control;2: Δhfq;3:WT.4–6:Hfq-F/Hfq-R.4:negative control;5:Δhfq;6:WT.7–9:Hfq-QC-F/Hfq-QC-R.7:negative control;8:Δhfq;9:WT.

Δrne-710∷Spe菌株在保證足夠糖供給的情況下，經(jīng)L-阿拉伯糖和IPTG誘導(dǎo)發(fā)生重組。pREDTKI分泌Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶，將連接到載體的融合片段酶切成線性游離狀態(tài)；pREDTKI分泌Red重組酶，促進(jìn)融合片段與壯觀霉素抗性盒發(fā)生同源重組，從而得到敲除株Δrne-710。為了準(zhǔn)確驗(yàn)證敲除株是否正確，需要3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。全長(zhǎng)引物敲除株有1384 bp大小的條帶，野生株有2440 bp大小的條帶，敲除株比野生株片段?。煌獠恳锴贸暧?51 bp大小的條帶，野生株有1607 bp大小的條帶，敲除株條帶明顯小于野生株，證明基因缺失了大片段；內(nèi)部引物敲除株沒(méi)有條帶，野生株有490 bp大小的條帶，對(duì)比野生株說(shuō)明敲除株rne-710基因缺失。圖示結(jié)果與預(yù)期條帶大小一致 (圖8)，表明無(wú)痕敲除Δrne-710構(gòu)建成功。

2.7 Δhfq敲除株pREDTKI質(zhì)粒消除鑒定

無(wú)痕敲除的Δhfq菌株含有pREDTKI質(zhì)粒，pREDTKI是溫敏型質(zhì)粒，通過(guò)高溫培養(yǎng)即可將其消除。此質(zhì)粒存在的適合溫度是30℃，本實(shí)驗(yàn)將溫度提高到42℃，低速培養(yǎng)2 h，菌液微渾濁即進(jìn)行稀釋涂板，選擇在陰性板生長(zhǎng)而在卡那霉素抗性板不生長(zhǎng)的菌株，再用無(wú)痕敲除鑒定引物以及卡那盒鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果可見(jiàn)，Δhfq內(nèi)引物、外引物和全長(zhǎng)引物均擴(kuò)增出目的條帶，pREDTKI質(zhì)粒鑒定引物擴(kuò)增的敲除株沒(méi)有條帶，野生株有613 bp大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖9)，表明敲除株pREDTKI質(zhì)粒消除成功。

圖8 Δrne-710敲除株的鑒定Fig.8 Identification of Δrne-710.M:DL 2000 DNA marker.1–3:Rne-QC-F/Rne-QC-R.1:negative control;2:Δrne-710;3:WT.4–6:Rne-I-F/Rne-I-R.4:negative control;5: Δrne-710;6:WT.7–9:Rne-F/Rne-R.7:negative control;8:Δrne-710;9:WT.

圖9 Δhfq敲除株pREDTKI質(zhì)粒消除鑒定Fig.9 Identification of Δhfq pREDTKI-cured.M:DL 2000 DNA marker.1–3:Hfq-I-F/Hfq-I-R.1:negative control;2:Δhfq;3:WT.4–6:Hfq-F/Hfq-R.4:negative control;5: Δhfq;6:WT.7–9:Hfq-QC-F/Hfq-QC-R.7:negative control;8:Δhfq;9:WT.10–12:TKI-Kan-F/TKI-Kan-R.10:negative control;11:Δhfq;12:WT(pREDTKI).

2.8 Δrne-710敲除株pREDTKI質(zhì)粒消除鑒定

無(wú)痕敲除的Δrne-710菌株含有pREDTKI質(zhì)粒，該質(zhì)粒的存在可能影響對(duì)菌株的后續(xù)操作。由于pREDTKI是溫敏型質(zhì)粒，提高培養(yǎng)溫度至42℃即可將其消除，培養(yǎng)后的菌液稀釋涂板，通過(guò)無(wú)抗性篩選即可得到消除菌株。經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，Δrne-710內(nèi)引物、外引物和全長(zhǎng)引物均擴(kuò)增出目的條帶，使用pREDTKI質(zhì)粒含有的卡那盒鑒定引物擴(kuò)增的敲除株沒(méi)有條帶，野生株有613 bp大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖10)，表明敲除株pREDTKI質(zhì)粒消除成功。

3 討論

大腸桿菌RNase E由Rne基因編碼，全長(zhǎng)1061 aa，分為N端催化區(qū) (1–529 aa)和支架區(qū) (430–1061 aa)。Hfq與 Rne結(jié)合位點(diǎn)在 711–750 aa。751–1061 aa對(duì)介導(dǎo)sRNA與靶mRNA降解是必需的。因此，本研究在不改變RNase E活性的情況下，保留N端催化區(qū)，在支架區(qū)從710 aa開(kāi)始敲除rne基因構(gòu)建Δrne-710。

圖10 Δrne-710敲除株pREDTKI質(zhì)粒消除鑒定Fig.10 Identification of Δrne-710 pREDTKI-cured.M:DL 2000 DNA marker.1–3:Rne-QC-F/Rne-QC-R.1:negative control; 2: Δrne-710; 3: WT. 4–6:Rne-I-F/Rne-I-R.4:negative control;5:Δrne-710;6:WT.7–9:Rne-F/Rne-R.7:negative control;8:Δrne-710;9:WT.10–12:TKI-Kan-F/TKI-Kan-R.10:negative control;11:Δrne-710;12:WT(pREDTKI).

常見(jiàn)的基因敲除方法一般選擇30–50 bp同源臂，對(duì)于一些特殊的基因，這種短同源臂利用一步法很難敲除，必須采用二步法才可實(shí)現(xiàn)，同源臂加長(zhǎng)到500 bp左右，采取融合PCR方法構(gòu)建含有同源臂與抗性基因的片段，再同源重組并篩選菌株達(dá)到敲除的目的。

本研究無(wú)痕敲除過(guò)程中，第一步的Red重組將同源臂設(shè)計(jì)為60 bp，按照常規(guī)一步法操作難以實(shí)現(xiàn)壯觀霉素抗性盒替換目的基因，后來(lái)改進(jìn)了試驗(yàn)方案。由于電轉(zhuǎn)時(shí)高強(qiáng)度的電擊會(huì)損傷菌的活性，因此，在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)菌液量由5 mL增加到20 mL，菌液的OD600由0.8增加到1.0以上，足夠多的菌量接受電擊，目的是保證轉(zhuǎn)化的活菌量。加入L-阿拉伯糖的時(shí)間由培養(yǎng)終止前1–2 h提前到接菌時(shí)同時(shí)加入L-阿拉伯糖，增加誘導(dǎo)時(shí)間。轉(zhuǎn)化時(shí)電擊后復(fù)蘇時(shí)間一般為1 h，本研究適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間為1–2 h，更容易獲得重組菌。

輔助質(zhì)粒的參與使得無(wú)痕敲除變得簡(jiǎn)單易行，pKSI-1載體多克隆位點(diǎn)上下游分別含有Ⅰ-SceⅠ酶切位點(diǎn)，兩個(gè)Ⅰ-SceⅠ位點(diǎn)范圍內(nèi)可以插入靶基因。本研究通過(guò)融合PCR構(gòu)建目的基因敲除片段作為靶基因，第一步分體PCR擴(kuò)增后不需要純化回收，直接用產(chǎn)物40倍稀釋作模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增即可得到融合片段。為了獲得較高的擴(kuò)增產(chǎn)量，對(duì)比LAtaq酶+pfu酶和EXtaq酶+pfu酶擴(kuò)增效果，發(fā)現(xiàn)使用LAtaq酶+pfu酶擴(kuò)增得到的條帶更亮，擴(kuò)增效率更高。用于融合片段的長(zhǎng)度在600 bp左右即可，太長(zhǎng)不利于融合，并且連接載體的效率也會(huì)降低。融合片段連接至pKSI-1載體后需要鑒定，PCR擴(kuò)增鑒定由于特異性較差，還需要測(cè)序相結(jié)合，關(guān)于測(cè)序鑒定需要注意的是：1)測(cè)序時(shí)不能使用PCR產(chǎn)物，否則測(cè)序結(jié)果發(fā)生的堿基突變，分不清是基因突變還是擴(kuò)增過(guò)程造成的；2)在pKSI-1載體上接近融合片段的兩端設(shè)計(jì)引物，使用特異引物進(jìn)行測(cè)序才能得到正確的結(jié)果。

得到的Δhfq∷Spe和Δrne-710∷Spe菌株分別含有 pKSI-1-Δhfq和 pKSI-1-Δrne-710質(zhì)粒，同時(shí)含有pREDTKI質(zhì)粒，抗性為卡那霉素、氨芐青霉素和壯觀霉素。如果想獲得無(wú)痕敲除的菌株，必須使pKSI-1載體上的缺失hfq和rne-710片段代替壯觀霉素盒，分別重組到Δhfq和Δrne-710敲除株中。在IPTG誘導(dǎo)條件下，pREDTKI分泌Ⅰ-SceⅠ酶，一方面，將pKSI-1載體的Ⅰ-SceⅠ酶切位點(diǎn)部位進(jìn)行酶切，此區(qū)域包含的融合片段即成線性，為進(jìn)一步的基因重組作好了準(zhǔn)備，在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下，pREDTKI質(zhì)粒發(fā)揮λ-Red重組功能，可以幫助實(shí)現(xiàn)替換過(guò)程；另一方面，含有Ⅰ-SceⅠ酶切位點(diǎn)的壯觀霉素和pKSI-1載體在Ⅰ-SceⅠ酶切作用下失活。通過(guò)卡那霉素抗性篩選，可以得到含有pREDTKI質(zhì)粒的無(wú)痕敲除菌株，pREDTKI為pKD46改造的質(zhì)粒，溫敏型的特點(diǎn)經(jīng)42℃培養(yǎng)即可將其消除。

本研究通過(guò)融合PCR方法構(gòu)建目的基因缺失片段，采用雙質(zhì)粒無(wú)痕敲除法，利用λ-Red系統(tǒng)與Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶相結(jié)合的技術(shù)，構(gòu)建了敲除株Δhfq和Δrne-710，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

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