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大鼠、豚鼠和金黃地鼠的尿液蛋白質(zhì)組比較

2018-05-10 09:31:29倪娜吳建強李梨高友鶴
生物工程學(xué)報 2018年4期
關(guān)鍵詞:豚鼠同源尿蛋白

倪娜,吳建強,李梨,高友鶴

1重慶醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心,重慶 400016

2北京師范大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 北京基因工程與生物技術(shù)重點實驗室,北京 100875

3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病理生理學(xué)系,北京 100005

尋找生物標志物最主要的就是尋找與生理以及病理生理過程相關(guān)的可監(jiān)測的變化[1]。尿液由于不受穩(wěn)態(tài)機制的調(diào)節(jié),可以反映體內(nèi)代謝的變化,收集方便,因此,尿液是尋找疾病標志物的良好生物學(xué)來源[2]。

然而人類臨床尿液樣本受到多種生理性或病理性的影響,例如年齡、性別、飲食狀況、運動以及藥物等[3]。而動物模型是尋找疾病因果關(guān)系最有效的方法,原因如下:1)使用動物模型可以減少遺傳和環(huán)境因素對尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的影響;2)有助于識別每個階段的生物標志物,包括早期診斷;3)因為臨床患者的治療是不可避免的,所以動物模型可以避免藥物對蛋白質(zhì)組的影響。因此,運用動物模型進行尿液蛋白標志物的研究,更經(jīng)濟節(jié)約,更單一可控,有利于早期觀察疾病和監(jiān)測疾病進展過程中的相關(guān)病理生理變化[4]。

在科研活動中,常用大鼠來建立疾病動物模型并進行蛋白質(zhì)組研究,例如大鼠腎病模型[5-6]、大鼠冠狀動脈疾病模型[7-9]、大鼠膀胱癌模型[10-11]等。但是大鼠并非所有疾病的優(yōu)勢模型動物,不同的疾病應(yīng)該選擇其相應(yīng)的優(yōu)勢模型動物,因此,研究其他動物的優(yōu)勢模型和蛋白質(zhì)組更為必要。地鼠 (Hamster)又名倉鼠,屬哺乳綱、嚙齒目、倉鼠科。常用于實驗動物的地鼠主要有金黃地鼠Mesocricetus auratus和中國地鼠Cricetulus gzriseus。金黃地鼠現(xiàn)有近交系38種,突變系17種,遠交群38種。地鼠在生物醫(yī)學(xué)中主要應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究、生殖生理和計劃生育研究、血管生理學(xué)和微循環(huán)研究、營養(yǎng)學(xué)研究和傳染病研究。地鼠是狂犬病毒、乙型腦炎病毒的研究及其疫苗生產(chǎn)的主要生物材料[12]。豚鼠Cavia porcellos又名天竺鼠,屬哺乳綱、嚙齒目、豚鼠科。豚鼠廣泛地用于免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)、毒理學(xué)和傳染病學(xué)研究。

本研究通過分析蛋白質(zhì)組比較大鼠、金黃地鼠和豚鼠的尿液蛋白質(zhì)的差異,旨在為醫(yī)學(xué)實驗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為優(yōu)勢動物模型的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

二硫蘇糖醇 (DTT)、碘乙酰胺 (IAA)、碳酸氫銨、尿素、硫脲、Tris等均購自Sigma公司。胰蛋白酶購自Promega公司。Oasis小柱購自Waters公司。

1.2 實驗動物

SPF級的雄性Sprague-Dawley大鼠 (170–200 g)、SPF級的雄性金黃地鼠 (80–100 g)、SPF級的雄性Hartley豚鼠 (200–250 g)由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,動物許可證SCXK(京)2012–0001)。動物實驗遵循北京師范大學(xué)生命科學(xué)院倫理委員會的審查和批準。所有動物均飼養(yǎng)于標準條件下,室內(nèi)溫度為 (22±1)℃,濕度為65%–70%。

1.3 尿蛋白樣品制備和LC-MS/MS分析

使用動物代謝籠裝置收集大鼠、金黃地鼠和豚鼠的尿液,于–80℃冰箱保存以備分析使用。提取尿液樣品蛋白過程:將未經(jīng)任何處理的大鼠、金黃地鼠和豚鼠凍存尿液 (大鼠取4 mL,金黃地鼠取4 mL,豚鼠由于尿液太稀,取全部尿液),分別2000×g、4℃離心30 min,取上清,置于新的EP管中,12000×g、4℃離心30 min取上清,目的是去除大的細胞碎片;然后用3倍體積的預(yù)冷乙醇于–20℃過夜沉淀蛋白;沉淀完成后,12000×g、4℃離心30 min,棄上清,取沉淀,加入適量的蛋白裂解液 (8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、25 mmol/L二硫蘇糖醇和50 mmol/L Tris)重新溶解尿蛋白[13];最后用Bradford方法測定蛋白濃度。

大鼠、金黃地鼠和豚鼠各5只通過膜上酶切方法進行質(zhì)譜分析。過程如下:用新配置好的UA溶液 (8 mol/L尿素加入0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.5)200 μL清洗 10 kDa濾膜 (Pall,Port Washington,NY,USA)兩次,18℃、14000×g離心5 min,棄去濾過液;再將200mg蛋白樣品加載到濾膜上,用UA和50 mmol/L NH4HCO3分別洗滌蛋白樣品兩次;再向濾膜上加入20 mmol/L DTT于37℃水浴1 h;然后再加入50 mmol/L IAA室溫避光作用45 min;加入胰蛋白酶 (1∶50)37℃孵育過夜[14];次日,離心收集肽段;最后將肽段通過HLB柱 (Waters,Milford,MA)脫鹽,最后通過真空泵 (Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)抽干。

將酶切后的肽段用0.1%的甲酸酸化后,使用ABSCIEX Triple-TOF5600質(zhì)譜儀 (Framing-ham,MA,US)進行質(zhì)譜分析并且獲得數(shù)據(jù)。

1.4 蛋白質(zhì)的鑒定和非標記定量

質(zhì)譜數(shù)據(jù)均使用Mascot軟件進行處理(version 2.5,Matrix Science,London,UK),并且在Swiss-Prot中進行搜索匹配。搜索條件如下:胰酶酶切,允許最大漏切位點兩個,固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化,可變修飾為蛋白質(zhì)N-末端乙?;图琢虬彼嵫趸?。

蛋白結(jié)果使用Scaffold軟件 (Version 4.4.6,Proteome Software Inc.,Portland,Oregon,USA)進行篩選并定量分析。檢索條件如下:肽段鑒定可信度≥90.0%,F(xiàn)DR≤1%,蛋白鑒定可信度≥95.0%,且包含兩個以上的特異肽段[15]。用譜圖數(shù)進行差異蛋白的篩選[16]。

1.5 尿蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

先將大鼠、金黃地鼠和豚鼠尿液中鑒定到的所有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成人的同源蛋白,再通過PANTHER數(shù)據(jù)庫 (http://www.pantherdb.org/)和Peptide Atlas數(shù)據(jù)庫 (http://www.proteinatlas.org/)分析。分別從分子功能、生物過程、細胞成分和通路等方面對大鼠、金黃地鼠和豚鼠尿液蛋白進行比較。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。三種鼠的尿液蛋白質(zhì)結(jié)果轉(zhuǎn)換成人的同源蛋白后,用單因素方差分析方法比較3種鼠的譜圖數(shù),然后再通過多重比較方法進行兩兩比較。所有實驗均重復(fù)3次,所有結(jié)果均以“±s”表示,組間差異P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿蛋白的SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE技術(shù)分析比較大鼠、金黃地鼠和豚鼠尿蛋白。差異如下:大鼠與其他兩種鼠相比,條帶差異較大,而金黃地鼠和豚鼠條帶較為相似;大鼠尿蛋白主要集中在35–15 kDa表達,而豚鼠和金黃地鼠在35–25 kDa之間表達較弱(圖 1)。

圖1 SDS-PAGE分析三種鼠尿液蛋白樣品Fig.1 SDS-PAGE analysis of urinary protein samples.R1–3:samples from rats;P1–3:samples from guniea pigs;H1–3:samples from golden hamsters.

2.2 尿蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較

將大鼠、金黃地鼠和豚鼠尿液蛋白質(zhì)譜鑒定的結(jié)果通過Mascot搜庫,再通過Uniprot分別與人的同源蛋白進行比對并轉(zhuǎn)換成人的同源蛋白進行比較 (附表1)。三種鼠與人同源蛋白比對結(jié)果顯示,豚鼠尿液所含人的同源蛋白有340個,大鼠尿液所含人同源蛋白266個,金黃地鼠尿液所含人同源蛋白366個。如圖2所示,有88個可信蛋白是3種鼠都有的,而有86個蛋白是大鼠獨有的,141個蛋白是豚鼠獨有的,160個蛋白是金黃地鼠獨有的。如圖3所示,豚鼠和金黃地鼠尿蛋白的相似性更大。

2.3 Gene ontology分析

大鼠、金黃地鼠和豚鼠尿液中鑒定到的所有蛋白質(zhì)通過PANTHER數(shù)據(jù)庫分析,分別從分子功能、生物過程、細胞成分和通路等方面對大鼠、金黃地鼠和豚鼠尿液蛋白進行比較 (圖4)。分析顯示,3種鼠的尿蛋白參與的生物過程和通路不同,具有不同的分子功能,而且細胞成分也不同。例如,豚鼠和金黃地鼠比大鼠參與鈣信號通路、整合素信號通路以及Wnt信號通路的尿蛋白更多。

圖2 大鼠、豚鼠和金黃地鼠尿蛋白比較Venn圖Fig.2 Rat,guinea pig and golden hamster urine protein comparison Venn diagram.The blue part represents 86 proteins that are unique to rats,the yellow part represents 141 proteins that are unique to guinea pigs,and the green part represents 160 proteins that are unique to golden hamsters.

圖3 三種鼠尿蛋白質(zhì)譜結(jié)果對比熱圖Fig.3 The heat map of three kinds of animal urine protein.From left to right are:rats,golden hamster and guinea pigs.The expression of protein in golden hamster and guinea pig is close.

圖4 Gene ontology分析Fig.4 Gene ontology analysis.There were significant differences in the expression of three animal proteins.(A)Molecular function.(B)Biological process.(C)Cellular component.(D)Pathway.

2.4 Peptide Atlas分析

將大鼠,豚鼠和金黃地鼠尿蛋白質(zhì)與Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫進行比對,結(jié)果顯示在泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)中,3種鼠的蛋白表達情況均不同,而且金黃地鼠尿蛋白在各個臟器的表達量都遠遠高于其他兩種鼠,大部分情況下大鼠尿蛋白表達量最低 (圖5)。

3 討論

圖5 大鼠、豚鼠和金黃地鼠與Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果Fig.5 The Human Protein Atlas result between rats,guinea pigs and golden hamsters.In different organs,the three animal urine protein expression was significantly different.Among them,the highest expression of golden hamsters,followed by guinea pigs,and finally rats.

尿液是尋找疾病生物標志物良好的生物學(xué)來源[17]。尿液作為機體的一種排泄物,不受機體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),能夠反映機體生理和病理的不同狀態(tài)[18],而且能夠更加及時、敏感地反映機體與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的早期變化。然而對于臨床研究樣品而言,尿液存在顯著個體差異,同時也受藥物、運動、飲食和生活習(xí)慣等的影響[19-21],而且臨床樣本復(fù)雜,難以選取同一個病理階段進行尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析,因此試驗結(jié)果重復(fù)性不好。而用動物建立疾病模型是一個簡單實用并且重復(fù)性好的篩選尿液生物標志物的方法。動物模型遺傳背景簡單、可控性強、實驗重復(fù)性好,容易建立疾病與尿液蛋白質(zhì)組之間變化體系。通過這種方法,不僅可以尋找疾病早期診斷的標志物,而且可以尋找疾病不同階段的變化標志物。

現(xiàn)階段,大鼠是常用的模型動物,而用豚鼠和金黃地鼠進行研究的報道少之甚少。截止到2017年8月1日,通過關(guān)鍵詞 (“rat”and “proteomics”)在PubMed上檢索到3873篇文章。而通過關(guān)鍵詞(“golden hamster”and “proteomics”) 和 (“cavia cobaya”and “proteomics”) 在PubMed上分別檢索到35篇和46篇文章。

本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較大鼠、金黃地鼠和豚鼠的尿液蛋白質(zhì),目的是為醫(yī)學(xué)實驗奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ),為優(yōu)勢動物模型的選擇提供線索。本研究中檢測到大鼠和豚鼠、金黃地鼠的尿液蛋白質(zhì)差異很大,從SDS-PAGE中能看出,3種鼠高豐度蛋白不同,豐度抑制不同,所以對蛋白組鑒定的影響也不同,相對來說豚鼠和金黃地鼠的蛋白表達情況更為相似。因此,僅僅用大鼠來建立疾病動物模型是不適合研究所有疾病的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)。

與此同時,我們分別將大鼠、金黃地鼠和豚鼠的尿液蛋白結(jié)果轉(zhuǎn)換成人的同源蛋白進行比對(附表1,可在網(wǎng)絡(luò)版中下載),可見3種鼠中大鼠與人的同源蛋白數(shù)量最少,有很多同源蛋白只在金黃地鼠和豚鼠中發(fā)現(xiàn),其中141個蛋白是豚鼠獨有的,160個蛋白是金黃地鼠獨有的,而這些同源蛋白參與人體各個系統(tǒng)各個器官的活動中。

我們將3種鼠轉(zhuǎn)換后的同源蛋白與Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫和PANTHER數(shù)據(jù)庫比對,在各個系統(tǒng)各個器官中,大鼠、豚鼠和金黃地鼠尿蛋白表達情況都不同,并且它們參與的生物過程也都不同,其中大鼠的表達量最少,這表明在建立人類疾病模型選擇模型動物的時候,金黃地鼠和豚鼠相對來說更占優(yōu)勢。例如在我們的數(shù)據(jù)中可以看出,在肝臟、胰腺中,金黃地鼠尿蛋白表達量高,而且目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,肝內(nèi)膽管癌和胰腺癌死亡率高,早期診斷困難,預(yù)后差,因此尋找這兩種疾病的尿液蛋白標志物尤為重要,通過查詢相關(guān)文獻,已有報道說明金黃地鼠是肝內(nèi)膽管癌和胰腺癌的優(yōu)勢模型動物[22-23]。在皮膚和肺中,豚鼠尿蛋白表達量雖然沒有金黃地鼠高,但是金黃地鼠尿量偏少且濃,在收取尿液樣本上,豚鼠更為合適,而且皮膚過敏、皮膚癬以及慢性阻塞性肺疾病在臨床的早期診斷與鑒別診斷都困難,且治療效果不佳,所以我們可以通過尋找尿液蛋白標志物進行鑒別診斷,監(jiān)測疾病進展和疾病療效,現(xiàn)已有報道驗證豚鼠是研究慢性阻塞性肺疾病、皮膚過敏、皮膚癬菌等疾病的優(yōu)勢模型[24-26]。通過以上的研究,可以指導(dǎo)疾病動物模型的選擇。例如在肝臟、胰腺疾病模型的選擇中,我們可以優(yōu)先考慮金黃地鼠,在皮膚等疾病模型中,我們可以優(yōu)先考慮豚鼠,再結(jié)合疾病和動物的自身特點以及之前的報道,正確選擇出優(yōu)勢模型。綜上所述,用豚鼠、金黃地鼠和大鼠選擇其相應(yīng)的疾病模型,提高了尿液蛋白標志物篩選的效率和準確率,在尋找人類疾病早期診斷的尿液蛋白標志物方面更有前景。

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