彭靜，王瓊，程小玲，劉夢(mèng)雯，王美，辛化偉

武漢科技大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，湖北 武漢 430065

單域抗體是由天然缺乏輕鏈的重鏈抗體改造而來的一類小型化抗體，具有結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、易于異源表達(dá)、同時(shí)與抗原結(jié)合的特異性和親和力高等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。近年來單域抗體在生物工程技術(shù)領(lǐng)域受到人們的重視，其應(yīng)用在逐漸推廣。經(jīng)典的單域抗體制備過程包括應(yīng)用駝科動(dòng)物等可天然產(chǎn)生重鏈抗體的動(dòng)物作為免疫宿主、通過抗原免疫、然后進(jìn)行抗體基因庫構(gòu)建、特異抗體篩選和克隆、大腸桿菌等異源表達(dá)等步驟[4-5]。改進(jìn)的方案包括利用非免疫動(dòng)物來源的抗體基因庫或半合成、全合成抗體基因庫進(jìn)行抗原靶標(biāo)的抗體篩選[6-7]。這兩種方法均存在步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。

hCG分子是人妊娠過程中產(chǎn)生的重要的標(biāo)志性激素分子，在某些腫瘤中也發(fā)現(xiàn)存在過表達(dá)[8-9]。其蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過晶體結(jié)構(gòu)解析等方法得到較深入的了解。應(yīng)用單域抗體技術(shù)制備hCG單域抗體的工作也開始有人進(jìn)行嘗試[10]。本研究結(jié)合過去人們?cè)趆CG結(jié)合多肽篩選工作和對(duì)單域抗體的通用骨架的選擇、測(cè)試工作的成果基礎(chǔ)上[11-12]，嘗試將hCG結(jié)合多肽嫁接到單域抗體通用骨架的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1或CDR3，測(cè)試改造后的單域抗體結(jié)合抗原的活性，為建立結(jié)合多肽嫁接抗體技術(shù)制備抗原特異單域抗體的方法提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a(+)質(zhì)粒、pET30a(+)-sfGFP質(zhì)粒、DP-GFP(一種GFP結(jié)合蛋白，本實(shí)驗(yàn)室制備)、LHB(促黃體生成素b亞基)+hCG-α轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞分泌上清、大腸桿菌BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR Clean up試劑盒購自Axygen公司。Ni-NTA親和柱購自生工生物工程(上海)股份有限公司。IPTG、考馬斯亮藍(lán)R-250購自AMRESCO公司。T4 DNA連接酶、蛋白marker購自Thermo Scientific公司。DNA marker購自東盛生物公司?；蚝铣捎珊贾萁鹞ㄖ枪就瓿?。DNA測(cè)序由武漢擎科有限公司完成。BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購自碧云天。JEG-3細(xì)胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。酶標(biāo)板購自BIOFIL公司。小牛血清購自四季青公司。SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀購自Molecular Devices。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

全基因合成anti-hCG-α基因片段[13]，在其上、下游分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，將其與pET30a(+)質(zhì)粒均用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶將酶切后經(jīng)膠回收純化的anti-hCG-α和 pET30a(+)DNA于 22℃連接2 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，并將雙酶切鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

全基因合成cAbBCII10-CDR1/hCGBP1、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3的基因片段[14-15]，在其上、下游分別引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，將其與pET30a-sfGFP質(zhì)粒均用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶將酶切后經(jīng)膠回收純化的cAbBCII10-CDR1/hCGBP1、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3和pET30a-sfGFP于22℃連接2 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ與BamHⅠ和HindⅢ兩種雙酶切鑒定，并將雙酶切鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.3 抗體融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將DNA測(cè)序正確的陽性克隆菌于37℃培養(yǎng)至OD600為 0.6?0.8時(shí)，加入 IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，誘導(dǎo)上述3種融合蛋白表達(dá)。取誘導(dǎo)后的菌液，10000 r/min離心2 min，棄上清收集菌體沉淀，一部分菌體直接加入SDS-PAGE電泳樣品處理液，用于檢測(cè)全菌蛋白；另一部分加入9倍體積的緩沖液Buffer H(20 mmol/LTris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl，10%甘油，10 mmol/L β-巰基乙醇，30 mmol/L咪唑)冰浴超聲破碎30 min，然后10000 r/min離心20 min，取上清和沉淀進(jìn)行電泳檢測(cè)。用12%SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)菌體全蛋白與超聲破碎上清和沉淀中的融合蛋白。

1.4 抗體融合蛋白的純化與鑒定

在最佳誘導(dǎo)條件下 (16℃，120 r/min)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。收集誘導(dǎo)后菌體超聲破碎的上清液，利用Ni-NTA親和柱，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行純化。分別收集親和柱穿透峰和洗脫峰，進(jìn)行12%的SDS-PAGE。然后收集洗脫峰透析去除咪唑。

1.5 抗體融合蛋白濃度的測(cè)定

取1.2 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn) (30 mg BSA)中，充分溶解后配制成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取20 μL 25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)加入980 μL稀釋液即可配制成0.5 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)。PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)樣品數(shù)量和標(biāo)準(zhǔn)曲線所用孔數(shù)12個(gè)，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，PBS補(bǔ)足到20 μL。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min后測(cè)定吸光度。

1.6 抗體融合蛋白的抗原結(jié)合活性測(cè)定

包被：用PBS與含5%的小牛血清配置成包被緩沖液，用PBS包被緩沖液將anti-hCG-α稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 μg/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用PBS洗滌緩沖液洗3次，每次3 min(簡稱洗滌，下同)。

加樣：加一定梯度稀釋JEG-3細(xì)胞分泌上清0.1 mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h。然后洗滌。同時(shí)空白孔作對(duì)照。

加抗體-sfGFP融合蛋白：于各反應(yīng)孔中，分別加入同濃度的cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP和cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP 0.1 mL，37℃孵育0.5–1 h，洗滌3次。

測(cè)定GFP熒光強(qiáng)度：于各反應(yīng)孔中，加入0.2 mL的PBS，于酶標(biāo)儀上測(cè)定，激發(fā)光波長為488 nm，熒光檢測(cè)波長為525 nm。

1.7 抗體融合蛋白的穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP和cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP與足量的DP-GFP(一種GFP結(jié)合蛋白)混勻，保證GFP標(biāo)簽的穩(wěn)定性。

取等份的上述混合物分別置于4℃、16℃、37℃、42℃、65℃、80℃的水浴中保溫30 min，取出待恢復(fù)至室溫。各取100 μL上清于聚苯乙烯板中，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，分析抗體融合蛋白的熱穩(wěn)定性。

分別取等份上述混合物，用伯瑞坦-羅賓森(Britton-Robinson)廣泛緩沖液調(diào)pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，4℃放置30 min，取出待恢復(fù)至室溫。各取100 μL于聚苯乙烯板中，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，分析抗體融合蛋白的酸堿穩(wěn)定性。

1.8 抗體融合蛋白的滴度測(cè)定

包被后，加一定相同濃度JEG-3細(xì)胞分泌上清0.1 mL于上述已包被的反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h，然后洗滌，同時(shí)空白孔作對(duì)照。于各反應(yīng)孔中，分別加入一定稀釋的cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP和cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP 0.1mL，37℃孵育0.5–1 h，洗滌3次。測(cè)定GFP熒光強(qiáng)度。

1.9 抗體融合蛋白的抗原結(jié)合特異性測(cè)定

包被后，分別加一定稀釋濃度JEG-3細(xì)胞分泌上清和LHB+hCG-α轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞分泌上清0.1 mL于上述已包被的反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h，然后洗滌，同時(shí)空白孔作對(duì)照。加抗體-sfGFP融合蛋白。測(cè)定GFP熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

pET30a-anti-hCG-a重組子經(jīng)酶切鑒定后得到兩條目的帶，大小約為5.3 kb和400 bp；pET30a-cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP重組子經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ酶切鑒定后得到兩條目的帶，大小約為6.1 kb和 400 bp，pET30a-cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP重組子經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定后得到兩條目的帶，大小約為5.3 kb和1.2 kb，分別與質(zhì)粒和抗體基因及抗體融合蛋白基因片段的預(yù)期分子量一致 (圖1)。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的序列一致，證明3個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

將 pET30a-anti-hCG-α、pET30a-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、pET30a-cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-cAbBCII10-sfGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)前后收集細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在3組樣品中均獲得了目標(biāo)蛋白的高表達(dá)，并且大部分存在于細(xì)菌裂解液的上清中，為可溶性蛋白，僅有少量在沉淀中。

圖1 重組質(zhì)粒pET30a-anti-hCG-α和pET30acAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP的構(gòu)建Fig.1 Construction of pET30a-anti-hCG-α and pET30acAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP recombinant plasmids.M1:1 kb DNA marker;M2:100 bp DNA marker;1:pET30a-anti-hCG-α digested with BamHⅠand Hind Ⅲ;2,3:pET30a-cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP digested with BamHⅠ and SalⅠ;4,5:pET30a-cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP digested with BamHⅠ and HindⅢ.

2.3 融合蛋白的純化與鑒定

pET30a-anti-hCG-α、pET30a-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、pET30a-cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-cAbBCII10-sfGFP大量表達(dá)菌超聲破碎后，收集上清，使用Ni-NTA親和柱純化后，最終得到高純度的融合蛋白，結(jié)果如圖3所示。通過計(jì)算，可知圖3中anti-hCG-α融合蛋白實(shí)際分子量約為25 kDa，蛋白理論分子量為22 kDa左右，二者基本相符；cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP融合蛋白實(shí)際分子量約為54 kDa，蛋白理論分子量為55 kDa左右，二者基本相符。

圖 2 anti-hCG-a和 cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP 融合蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of anti-hCG-aand cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins.(A)Expression of anti-hCG-ausion proteins.M:protein marker;1:before induction;2:after induction;3:supernatant;4:precipitate.(B)ExpressionofcAbBCII10-hCGBP1-sfGFP fusion proteins.M:protein marker;1:before induction;2:after induction;3:supernatant;4:precipitate.Expression of cAbBCII10-hCGBP3-sfGFP fusion proteins.5:before induction; 6: after induction; 7: supernatant; 8:precipitate.

圖 3 anti-hCG-a和 cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP 融合蛋白的純化Fig.3 Purification of anti-hCG-a and cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins.(A)Purification of anti-hCG-a fusion proteins.M:protein marker,1–6:eluents of Ni-NTA affinity chromatography resin;7–8:flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;9:total protein.M:protein marker.(B)Purification of cAbBCII10-hCGBP1-sfGFP fusion proteins.M:protein marker;1:total protein;2:flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3–9:eluents of Ni-NTA affinity chromatography resin.(C)Purification of cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins.1:total protein;2,3:flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;4–9:eluent of Ni-NTA affinity chromatography resin.

2.4 融合蛋白的濃度測(cè)定及抗體融合蛋白的抗原結(jié)合活性分析

通過BSA蛋白測(cè)定法可以得出pET30a-antihCG-α、pET30a-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、pET30a-cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP三個(gè)融合蛋白的濃度分別為0.65、2.43、3.60 mg/mL。

以anti-hCG-a蛋白作為捕獲抗體，以cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP或cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP為探測(cè)抗體測(cè)定與hCG的結(jié)合活性，結(jié)果如圖4所示。二者對(duì)hCG皆有一定結(jié)合活性，CDR3嫁接抗體 (hCGBP3)的抗原結(jié)合活性比CDR1嫁接抗體 (hCGBP1)約高2–3倍。

2.5 抗體融合蛋白的穩(wěn)定性

通過圖5A可以看出，溫度對(duì)兩種抗體融合蛋白cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP的穩(wěn)定性均有很大影響。其穩(wěn)定性在42℃以內(nèi)基本不變，在65℃時(shí)幾乎完全喪失穩(wěn)定性。

同樣的，通過圖5B可以看出，pH對(duì)兩種抗體融合蛋白cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP也有很大影響。融合蛋白的穩(wěn)定性在pH<7的范圍內(nèi)隨pH的降低而降低，在pH 4時(shí)幾乎喪失穩(wěn)定性，在 pH 8–10的范圍內(nèi)穩(wěn)定性只有少量下降(10%–20%)。

2.6 抗體融合蛋白的滴度

以梯度稀釋的cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP或cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP為探測(cè)抗體測(cè)定與hCG的結(jié)合活性，結(jié)果如圖6所示，cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP這兩種抗體融合蛋白的滴度約為1∶15。

2.7 抗體融合蛋白的抗原結(jié)合特異性

以JEG-3培養(yǎng)細(xì)胞上清液或LHB+hCG-α轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液作為抗原，以cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP或cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP為探測(cè)抗體，測(cè)定、比較對(duì)兩種相似抗原 (hCG和LH)的結(jié)合特異性，結(jié)果如圖7所示，兩種抗體融合蛋白對(duì)hCG和結(jié)合活性都高于對(duì)LH的結(jié)合活性，對(duì)LH有一定的交叉結(jié)合活性；cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP對(duì)hCG的結(jié)合特異性較高。

圖4 融合蛋白cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP結(jié)合hCG的活性測(cè)定Fig.4 Determination of hCG-binding affinity of cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins. (A)HCG-binding curve against Ag relative concentration.(B)HCG-binding curve against log2 of Ag relative concentration.

圖5 抗體融合蛋白的穩(wěn)定性測(cè)定Fig.5 Determination of the stability of cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins.(A)Relative protein stability at different temperatures.(B)Relative protein stability at different pH.

3 討論

圖6 抗體融合蛋白的滴度測(cè)定Fig.6 Determination of the titers of cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins.

圖7 抗體融合蛋白的抗原結(jié)合特異性測(cè)定Fig.7 Determination of antigen-binding specificity of cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins.Binding affinities of cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP fusion proteins to hCG and LH were compared.

應(yīng)用單域抗體骨架、抗原結(jié)合肽取代CDR可變區(qū)的方法制備新嫁接抗體的技術(shù)是一種改善結(jié)合多肽的生化性能的重要手段。近年來已有相關(guān)的研究報(bào)道，嫁接后的抗體分子比游離多肽具有更好的生化穩(wěn)定性，可勝任多種細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)用[16-17]。單域抗體骨架具有結(jié)構(gòu)簡單、CDR區(qū)易于進(jìn)行改造操作的優(yōu)點(diǎn)，作為嫁接抗體的骨架逐漸受到人們的重視。在本研究中，我們應(yīng)用單域抗體的一個(gè)通用骨架cAbBCII10[15]，通過將hCG分子的結(jié)合多肽嫁接到CDR1或CDR3區(qū)，檢測(cè)其對(duì)抗原分子的結(jié)合活性，獲得了具有一定親和力的CDR1或CDR3嫁接抗體形式，其中，CDR3比CDR1嫁接抗體結(jié)合抗原的效果好。

CDR3通常是抗體分子結(jié)合抗原的主要決定區(qū)域，因此被作為人工改造抗體的首選區(qū)域。如有文獻(xiàn)報(bào)道，通過CDR3區(qū)隨機(jī)化，篩選獲得了可結(jié)合重要醫(yī)藥靶標(biāo)的抗體分子[11]；Inoue等通過類似篩選方法獲得了針對(duì)不同抗原的CDR3改造抗體分子[18]，本研究也顯示CDR3嫁接抗體的抗原結(jié)合活性強(qiáng)。但是也有少數(shù)例外的情況，如Hattori等在用無機(jī)分子的結(jié)合多肽制備的嫁接抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)CDR3嫁接抗體不能結(jié)合抗原分子，而CDR1嫁接抗體具有很高的抗原結(jié)合活性，推測(cè)是由于多肽鏈的構(gòu)象不適當(dāng)所致[16]。

嫁接到抗體CDR區(qū)的多肽的構(gòu)象與游離多肽相比通常會(huì)發(fā)生改變，由于抗體骨架的剛性限制，嫁接多肽的空間活動(dòng)受到限制，從而使其在某一構(gòu)象或動(dòng)態(tài)構(gòu)象區(qū)域活動(dòng)，這可能會(huì)增強(qiáng)或減弱其對(duì)抗原的識(shí)別與結(jié)合[19]。我們注意到cAbBCII10通用骨架的CDR1區(qū)的周邊有較多的GGS序列，可能會(huì)賦予CDR1多肽更大的活動(dòng)空間；而CDR3可能受到更多的限制從而獲得更加穩(wěn)定的構(gòu)象。哪一個(gè)更適合多肽結(jié)合抗原，應(yīng)視結(jié)合多肽空間構(gòu)象是否與抗原表面更加契合決定。

我們所采用的通用骨架的CDR2區(qū)域?qū)τ诳贵w分子的骨架穩(wěn)定性起著重要作用，已有實(shí)驗(yàn)顯示，如將CDR2區(qū)的氨基酸殘基改變后，其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降[16]，因此，在本研究中我們沒有重復(fù)這一嘗試。CDR1或CDR3嫁接的抗體分子穩(wěn)定性較好。單域抗體通常具有較好的生化特性，并易于進(jìn)行異源表達(dá)，可溶性好。我們用大腸桿菌表達(dá)的嫁接抗體均表現(xiàn)出較高的可溶性，同時(shí)有少量包涵體形成，其中CDR1嫁接抗體較CDR3嫁接抗體有較多的包涵體。盡管嫁接抗體與大多數(shù)天然單域抗體相比，有少量包涵體形成，但與其他類型的抗體如單鏈抗體ScFV相比，其表達(dá)量和可溶性的差異都非常顯著。我們的嫁接抗體的可溶性的變化應(yīng)是受嫁接多肽的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象影響，嫁接改造的CDR區(qū)域通常因缺乏與抗體框架區(qū)或CDR區(qū)等其他區(qū)域的關(guān)聯(lián) (如形成二硫鍵)[20-21]，從而可能影響了其可溶性等生化性能。我們獲得的嫁接抗體具有一定的熱穩(wěn)定性和較好的堿耐受性，在一定程度上保留了所用單域抗體框架較為穩(wěn)定的特性。

嫁接抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性由所接入的多肽片段決定，在本研究中，我們所接入的hCG結(jié)合片段對(duì)hCG具有較特異的結(jié)合活性，但同時(shí)與相似抗原LH有一定的交叉結(jié)合活性，仍需進(jìn)一步優(yōu)化以提高其對(duì)hCG的結(jié)合特異性，在以后的工作中可通過結(jié)合多肽的突變掃描等方法進(jìn)行嘗試。

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