劉倩倩，黃煜*，顏莉莉，張鵬，張清宇，杜美蓉

(1.青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院，青島 266000；2.復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科研究所，上海 200000)

人早孕期母-胎界面主要發(fā)生三個生理事件：子宮內(nèi)膜蛻膜化、滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育與胎盤形成、母-胎之間的復(fù)雜對話。母胎界面形成中，子宮蛻膜聚攏了大量的免疫細(xì)胞，參與母胎免疫耐受的形成，其中蛻膜NK細(xì)胞(dNK)含量最多，約占50%～70%，蛻膜T細(xì)胞(dT)約占10%～15%，蛻膜單核巨噬細(xì)胞(dMΦ)約占10%～15%，幾乎不含有B細(xì)胞[1-2]。與dNK細(xì)胞不同的是，dMΦ在整個妊娠過程中數(shù)量并不會發(fā)生明顯的變化[3]。在不同微環(huán)境的誘導(dǎo)下單核-巨噬細(xì)胞可形成不同的表型，發(fā)揮不同的功能。根據(jù)表型和功能不同，單核巨噬細(xì)胞主要分為兩型即經(jīng)典M1型巨噬細(xì)胞，主要表達(dá)共刺激分子CD80和CD86，可分泌TNF-a、IL-8等大量的促炎性細(xì)胞因子，影響母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，不利于胎盤的植入和妊娠的維持[4-5]。在正常母胎界面偏向于分化為非經(jīng)典的M2型巨噬細(xì)胞，主要表達(dá)表面分子CD206，可釋放大量的抗炎細(xì)胞因子如IL-10，抑制母體的免疫反應(yīng)，參與免疫耐受，有利于妊娠的維持[6-8]。

我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞可以分泌高水平CXCL16，通過與其唯一受體CXCR6相互作用選擇性的招募外周單核細(xì)胞聚集到蛻膜局部并且保持穩(wěn)定，從而促進(jìn)自身的生長和侵襲；然而這些被募集而來的CXCR6+巨噬細(xì)胞在蛻膜局部的表型與功能如何，目前仍不明確[9]。因此在前期工作的基礎(chǔ)上，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對正常早孕組和自然流產(chǎn)組婦女CXCR6+/-dMΦ的表型進(jìn)行分析，揭示其在母胎免疫耐受中可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、材料

1.實驗標(biāo)本： 于上海復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院門診手術(shù)室選擇正常早孕期(6～10周)行人工流產(chǎn)的患者40例及早孕期無明確原因自然流產(chǎn)患者20例。

正常早孕組的收集標(biāo)準(zhǔn)：20～35歲計劃外妊娠；術(shù)前無感染、發(fā)熱等其他基礎(chǔ)疾病。不明原因發(fā)生自然流產(chǎn)患者的收集標(biāo)準(zhǔn)：20～35歲，排除染色體異常、生殖道畸形、發(fā)熱等其他疾病。

本研究經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)，取得患者知情同意后，收集蛻膜組織于DMEM/F12培養(yǎng)液中，1 h內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行細(xì)胞分離。

2.實驗試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、PBS、RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco，美國)；Percoll分離液，Collagenase Ⅳ(Sigma，美國)；DNase I(Applichem，德國)；流式抗體(Biolend，美國)：APC anti-human CXCR6、FITC anti-human CD14、BV421 anti-human CD45、PE anti-human CXCR6、PE/CY7 anti-human CD80、CD206。

二、實驗方法

1.分離蛻膜免疫細(xì)胞群(DIC)：將收集到的蛻膜組織置于100 mm的培養(yǎng)皿中，PBS充分洗滌，去除血塊，將組織充分剪碎(約1 mm×1 mm×1 mm)，吸入50 ml離心管中，加入0.1 % DNase I及0.1% Collagenase Ⅳ，放入37℃搖床震蕩消化30～40 min。將消化后的組織依次經(jīng)過100目、300目、400目的濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 500 rpm離心8 min，去上清液，將細(xì)胞重懸于2 ml RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后平鋪于20%、40%、60% 3個梯度的Percoll分離液上，2 500 rpm離心20 min。40%～60%密度區(qū)域的細(xì)胞即為分離的蛻膜免疫細(xì)胞群，將細(xì)胞洗滌并重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液中備用。

2.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測dMΦ表面分子的表達(dá)：將分離的蛻膜免疫細(xì)胞用PBS充分洗滌后，根據(jù)樣本的細(xì)胞數(shù)和抗體推薦用量加入CXCR6、CD45、CD14及表面分子CD80、CD206流式抗體，4℃避光孵育30 min，充分洗滌后加入適量PBS重懸，采用Beckman流式儀(型號CyAn ADP)檢測，F(xiàn)lowjo 7.6.1對結(jié)果進(jìn)行處理分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、雙色熒光標(biāo)記分析dMΦ兩組在DIC中的占比

采用CD45、CD14標(biāo)記dMΦ，首先對蛻膜免疫細(xì)胞群“開窗”于CD45+細(xì)胞群(圖1A)，分析其CD14的標(biāo)記情況(圖1B)。流式結(jié)果分析顯示，不明原因自然流產(chǎn)組CD14+dMΦ在DIC中所占比例為(9.9±1.63)%，正常早孕期組CD14+dMΦ在DIC中所占比例為(8.9±0.88)%，兩組差異并無顯著性(P>0.05)(圖1C)。

A： CD45標(biāo)記dMΦ的流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖；B： CD14標(biāo)記dMΦ的流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖；C：兩組dMΦ在DIC中占比統(tǒng)計圖圖1 正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組婦女蛻膜單核-巨噬細(xì)胞在蛻膜免疫細(xì)胞群中的占比

二、三色熒光標(biāo)記分析正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組CXCR6+在dMΦ中的表達(dá)情況

圖2是流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖。其中雙陽細(xì)胞為CD14+CXCR6+的dMΦ，在正常早孕組及不明原因自然流產(chǎn)組中均有表達(dá)。正常早孕期組中，CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)率為(40.0±1.90)%；不明原因自然流產(chǎn)組中，CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)率為(31.22±2.38)%，兩組比較差異顯著(P<0.05)。

三、多色熒光流式細(xì)胞術(shù)分析比較兩組蛻膜組織中CD14+CXCR6+/-dMΦ的表型差異

結(jié)果顯示：正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組中，M2型巨噬細(xì)胞表面分子CD206在CD14+CXCR6+dMΦ中表達(dá)率較CD14+CXCR6-dMΦ均顯著增高(P<0.05)，且CD206在正常早孕組CD14+CXCR6+dMΦ和CD14+CXCR6-dMΦ中的表達(dá)均顯著高于不明原因自然流產(chǎn)組(P<0.05)；正常早孕組中，M1型巨噬細(xì)胞表面分子CD80在CD14+CXCR6+dMΦ中表達(dá)率顯著高于CD14+CXCR6-dMΦ(P<0.01)，而自然流產(chǎn)組中，CD80在CD14+CXCR6+dMΦ和CXCR6-dMΦ的表達(dá)率并無顯著性差異(P>0.05)。正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組相比，CD80在兩組CD14+CXCR6+dMΦ的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，在正常早孕組CD14+CXCR6-dMΦ中的表達(dá)顯著低于不明原因自然流產(chǎn)組(P<0.01)(圖3)。

A： 兩組CXCR6+在dMΦ中均有表達(dá)流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖；B：CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)率統(tǒng)計結(jié)果圖；兩組比較，*P<0.05圖2 流式三色熒光標(biāo)記分析正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)情況

A：正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組中CD206 在CD14+CXCR6+dMΦ表達(dá)率；B：正常早孕組中CD80在CD14+CXCR6+dMΦ表達(dá)率；兩組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 正常早孕期與不明原因自然流產(chǎn)組CD14+CXCR6+/-dMΦ的表型比較

討 論

正常妊娠的過程中，母胎界面的細(xì)胞免疫即Th1型免疫反應(yīng)下調(diào)，體液免疫即Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢，形成了特殊的免疫耐受環(huán)境，對于成功妊娠具有重要作用[10]。單核細(xì)胞可從外周遷移到蛻膜局部，分化為巨噬細(xì)胞在蛻膜局部大量聚集，通過與滋養(yǎng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相互作用，釋放大量的IL-10、IL-8、PGE2等細(xì)胞因子參與母胎免疫耐受的建立，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎的植入和胎盤發(fā)育的全過程[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，對比正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組，dMΦ的數(shù)量并沒有明顯的變化，可能由于單核-巨噬細(xì)胞免疫功能發(fā)生改變，呈現(xiàn)高度易激活狀態(tài)，使母體對胎兒產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)多種趨化因子及其受體是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要分子，對 Th1/Th2 型細(xì)胞因子的分化、極化及Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫平衡的調(diào)節(jié)具有重要作用[12]。CXCR6是目前已知趨化因子CXCL16的唯一受體，在本實驗中，相對于正常早孕期組，不明原因自然流產(chǎn)組蛻膜組織中CXCR6+dMΦ在蛻膜的局部的聚集明顯減少，提示CXCR6+dMΦ可能在維持早孕期的母胎界面正常妊娠中發(fā)揮重要作用。

普遍認(rèn)為，蛻膜免疫細(xì)胞可通過獨(dú)特的表型和分泌大量的細(xì)胞因子參與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲、和分化，從而在母胎界面形成了獨(dú)特的免疫耐受微環(huán)境[13]。在外周血單核細(xì)胞中，80%分化為具有較強(qiáng)抗原提呈功能的經(jīng)典M1型單核-巨噬細(xì)胞，而在正常早孕期母胎界面蛻膜免疫細(xì)胞中單核-巨噬細(xì)胞在可溶性HLA-G5及細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-10和M-CSF的誘導(dǎo)下更趨向于分化為具有免疫抑制作用的非經(jīng)典M2型巨噬細(xì)胞[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤微缺氧環(huán)境中，CXCR6的表達(dá)水平與組織局部M2型單核細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，CXCL16/CXCR6可介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的活性，并且使其更趨向于分化為具有免疫抑制作用的M2型巨噬細(xì)胞，參與腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移[14]。在正常早孕期母胎界面也存在著類似于腫瘤的缺氧微環(huán)境，影響著滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和子宮螺旋動脈的生成[15]。我們通過實驗發(fā)現(xiàn) M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD206在正常早孕期和不明原因自然流產(chǎn)婦女CXCR6+dMΦ中的表達(dá)都要顯著高于CXCR6-dMΦ，這提示在早孕期母胎界面CXCR6可介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞趨向于分化為M2型巨噬細(xì)胞。同時實驗還發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞表面分子CD80在正常早孕期婦女CXCR6+dMΦ中的表達(dá)高于CXCR6-dMΦ，而在不明原因自然流產(chǎn)婦女CXCR6+/-dMΦ的表達(dá)水平無明顯差異，提示CXCR6與母胎界面促炎性M1型巨噬細(xì)胞在不明原因自然流產(chǎn)中的高度聚集相關(guān)。

由此可見，CXCR6不僅參與募集和吸引母體外周血免疫細(xì)胞到達(dá)并停留于妊娠子宮，還可能對局部的免疫細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，維持M1/M2型巨噬細(xì)胞達(dá)到一定比例的動態(tài)平衡。我們實驗還發(fā)現(xiàn)，在不明原因自然流產(chǎn)婦女CXCR6+dMΦ中，M2型巨噬細(xì)胞比例降低，M1型巨噬細(xì)胞在CXCR6-dMΦ中的比例升高，更驗證了CXCR6可能參與了早孕期M2型巨噬細(xì)胞在蛻膜組織中的形成和分化及蛻膜局部TH2型免疫偏倚的形成，當(dāng)不明原因自然流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生時，CXCR6的表型和功能特性也會發(fā)生改變，從而改變母胎界面的免疫微環(huán)境，打破免疫耐受的平衡狀態(tài)。

總之，在不明原因自然流產(chǎn)中，蛻膜單核-巨噬細(xì)胞數(shù)量比例并未發(fā)生明顯變化，CXCR6可能通過介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞的分化，影響母胎界面免疫耐受，此發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供了新的思路，但其相關(guān)功能特性，影響機(jī)制和通路還需進(jìn)一步的實驗研究。

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