張菁華，周永翠，唐愛發(fā)*

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣州 510275；2.深圳市第二人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，深圳 518037)

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，采用Affymetrix公司的小鼠全基因組表達(dá)譜芯片篩選出一批睪丸特異性表達(dá)新基因，其中一個(gè)睪丸特異性基因是SPACA7(原命名為T279)，小鼠不同組織、器官、細(xì)胞系的高通量基因表達(dá)模式顯示，SPACA7僅在睪丸組織中特異表達(dá)[1]。SPACA7屬于精子頂體結(jié)合蛋白家族成員，該蛋白家族成員只有SPACA3和SPACA5具有較高的氨基酸同源性，其它成員同源性不高。有報(bào)道表明，在小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)生過程中有超過50%的基因組基因發(fā)生表達(dá)，但是僅僅只有4%的基因組基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)于該基因的時(shí)空表達(dá)以及表達(dá)強(qiáng)度等至關(guān)重要，本文旨在通過分析SPACA7 16對(duì)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，篩選SPACA7的有效啟動(dòng)子，為日后研究SPACA7的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控做基礎(chǔ)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及試劑

1.研究對(duì)象：人腎上皮細(xì)胞293T(購自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC，CRL-3216)。

2.主要試劑：pGL3-basic、Renilla質(zhì)粒和Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真DNA聚合酶primer STAR、DNA聚合酶ExTaq以及相關(guān)PCR試劑購自日本TakaRa公司；RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、HindⅢ 和T4DNA連接酶購自美國New England Biolabs公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；胎牛血清及培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。

3.主要儀器：PCR儀(ABI Veriti，美國)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GelDoc，美國)、酶標(biāo)儀(THERMO FISHER Multiskan FC，美國)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.SPACA7基因啟動(dòng)子序列獲取及引物設(shè)計(jì)和合成：使用Promoter 2.0和Neural Network Promoter Prediction對(duì)SPACA7基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析，在NCBI的GeneBank中查找，獲取人類SPACA7基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp與下游84 bp序列。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)16對(duì)啟動(dòng)子引物(表1)，上游引物含XhoⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，下游引物含HindⅢ 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。

表1 PCR引物序列

2.細(xì)胞培養(yǎng)：293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.人腎上皮細(xì)胞293T基因組DNA提?。捍臃N于T25培養(yǎng)瓶的293T細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期、80%左右融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，1×PBS清洗3次，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集于離心管中，參照QIAGEN基因組DNA提取試劑盒說明書提取293T細(xì)胞基因組DNA。

4. PCR擴(kuò)增SPACA7啟動(dòng)子序列和pGL3-basic表達(dá)載體構(gòu)建：以上述提取的基因組DNA為模板，采用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。PCR反應(yīng)程序如下：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s至2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃+∞。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行凝膠回收。XhoⅠ和HindⅢ 雙酶酶切膠回收產(chǎn)物和pGL3-basic載體。上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和凝膠回收純化，將純化回收的不同長度的啟動(dòng)子片段與載體大片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，測(cè)序進(jìn)行鑒定。

5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測(cè)：經(jīng)測(cè)序鑒定成功的質(zhì)粒菌種進(jìn)行無內(nèi)毒素大量質(zhì)粒抽提，轉(zhuǎn)染前用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋各質(zhì)粒濃度至1 μg/μl，將重組質(zhì)粒與內(nèi)參pRL-TK同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，pGL3-SPACA7和Renilla的用量分別為1 μg/孔和0.02 μg/孔，轉(zhuǎn)染試劑為2 μg/孔。轉(zhuǎn)染12 h后，給細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞，吸掉培養(yǎng)基后用1×PBS清洗三次，然后加入100 μl裂解液室溫下輕緩晃動(dòng)15 min，收集細(xì)胞裂解液，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System說明書，使用Thermo VARIOSCAN FLASH 3001多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光素酶活性。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

三、統(tǒng)計(jì)分析

獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次；數(shù)據(jù)由SPSS軟件(SPSS Inc，Chicago，IL)處理。

結(jié) 果

一、SPACA7基因的篩選和鑒定

我們采用人全基因組芯片與胚胎睪丸探針和成人睪丸探針差異雜交篩選出一個(gè)在成人睪丸中高表達(dá)的SPACA7基因。采用小鼠和人同源基因比較分析，我們找到了相應(yīng)的小鼠同源基因，我們研究發(fā)現(xiàn)小鼠Spaca7基因的芯片雜交信號(hào)校正值在4、9、18、35、54日齡和6月齡小鼠睪丸中分別為0.9、0.2、3.9、659.8、726.3和793.6，可見Spaca7基因在18日齡之前小鼠睪丸組織中基本不表達(dá)，在18日齡之后才開始表達(dá)，并隨日齡的增加表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖1A)。

為了驗(yàn)證上述GeneChip結(jié)果，我們對(duì)4、6、9、11、15、19、24、31、36、40和54天小鼠的睪丸組織進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示Spaca7轉(zhuǎn)錄本僅在出生后15 d的睪丸組織中開始檢測(cè)到，且隨著日齡的增加其表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖1B)。RT-PCR分析結(jié)果與上述不同日齡小鼠睪丸的芯片分析結(jié)果有細(xì)微的差別，但在整體上都反映出Spaca7基因的表達(dá)呈現(xiàn)年齡依賴性特征。由此可見，Spaca7基因在小鼠睪丸組織中的表達(dá)具有時(shí)間依賴性，幼年期不表達(dá)，成年期高表達(dá)，提示Spaca7基因主要在成年期小鼠睪丸組織中發(fā)揮作用。

A：小鼠Spaca7基因在不同日齡小鼠睪丸中的GeneChip雜交值；B：RT-PCR分析Spaca7基因在不同日齡小鼠睪丸中的表達(dá)特征；d：日齡；NC：陰性對(duì)照?qǐng)D1 小鼠Spaca7基因的GeneChip和RT-PCR分析

二、SPACA7基因的生物信息學(xué)分析

人SPACA7基因(GeneBank登錄號(hào)：NM_145248)定位于染色體13q34位點(diǎn)，其cDNA長度773 bp，在32～619 bp之間有一閱讀框，含有588 bp的完整開放閱讀框，編碼一個(gè)由195個(gè)氨基酸組成、分子量為21.48 KDa的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)4.65，32～34處為起始密碼子ATG，617～619處為終止密碼子TGA，SPACA7蛋白在1～19位氨基酸處有跨膜區(qū)。將SPACA7 cDNA序列輸入數(shù)據(jù)庫進(jìn)行不同物種序列BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸有同源基因Spaca7(GenBank登錄號(hào)：NM_024279)，其定位于染色體8A2位點(diǎn)，其cDNA長度761 bp，開放閱讀框549 bp，編碼一個(gè)182個(gè)氨基酸，分子量為19.94 KDa的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)4.56，58～60 bp處為起始密碼子ATG，604～606 bp處為終止密碼子TAG。人和小鼠SPACA7基因的核苷酸序列達(dá)到64.5%的同源性，其編碼的蛋白氨基酸序列比對(duì)相同率達(dá)到45%(圖2)，說明SPACA7是一個(gè)人-鼠同源基因。

三、SPACA7啟動(dòng)子的克隆與鑒定

以293T細(xì)胞基因組DNA為模板，表一所列引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一系列大小不同的特異性條帶(圖3)。將PCR產(chǎn)物純化之后酶切、連接，得到重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果與NCBI記錄信息一致。

圖2 SPACA7基因核苷酸序列在人和小鼠中的同源性比較

圖3 SPACA7啟動(dòng)子克隆PCR產(chǎn)物

四、雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果

將構(gòu)建成功的pGL3-SPACA7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，收集細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pGL3-Basic空載質(zhì)粒(VEC)的陰性對(duì)照組比其它的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組熒光活性都要低，說明各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后均表現(xiàn)出了啟動(dòng)子活性。通過比較16個(gè)不同長度啟動(dòng)子與空載體的相對(duì)熒光素酶活性，其中以pGL3-SPACA7-F2(-1 500 bp～+84 bp)啟動(dòng)子活性最強(qiáng)(圖4)。

圖4 熒光素酶檢測(cè)結(jié)果

討 論

迄今為止，各國科學(xué)家采用基因芯片和生物信息學(xué)分析等技術(shù)，推測(cè)哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程中表達(dá)的睪丸特異性基因達(dá)2 300多個(gè)[2]，它們參與生物發(fā)育過程的各個(gè)階段，如染色質(zhì)包裝(Prm1[3]、Prm2[4]、Prm3[5]、Tnp1[6]、Tnp2[6]、H1FNT[7])，精子尾部形成(Tektin-t[8]、Vdac3[9]、Sepp1[10]、Akap4[11]、Spag6[12]、MEIGI[13])，能量代謝(Gapds[14]、sAC[15]、SLO3[16]、PRSS21[17])，頂體形成(Agfg1[18]、Gopc[19]、CD59b[20]、GBA2[21]、SPATA16[22])，透明帶結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)(Tenr[23]、Clgn[24]、Catsper1-4[25])等重要過程，因此研究睪丸特異性表達(dá)基因具有重要意義。

我們利用啟動(dòng)子截短實(shí)驗(yàn)獲得了SPACA7不同長度系列啟動(dòng)子16個(gè)，對(duì)其進(jìn)行了熒光素酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在-1 500 bp至+84 bp區(qū)域具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，而-2 000 bp至+84 bp區(qū)域啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較低，說明在-2 000 bp至-1 500 bp區(qū)域啟動(dòng)子上可能存在一段增強(qiáng)子，促進(jìn)SPACA7基因的表達(dá)，而與該增強(qiáng)子相互作用的反式作用因子還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

SPACA7在人類、小鼠、黑猩猩、獼猴中有同源物，但是這些蛋白沒有保守的結(jié)構(gòu)域，并且其功能尚不明確。已知SPACA家族成員具有相似的表達(dá)定位，因此研究SPACA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有重要意義。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SPACA7的啟動(dòng)子上具有AP1、USF、GATA-1、MZF1、SRY和RUNX1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中SOX基因家族主要在減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，在圓形精子中表達(dá)量最高。SOX基因家族成員是否參與SPACA7的基因表達(dá)調(diào)控還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這里我們鑒定到了具有高轉(zhuǎn)錄活性的SPACA7啟動(dòng)子對(duì)其表達(dá)調(diào)控的研究具有重要意義。

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