郭穎，王曉尉，周芳，安琪，谷翊群*

(1.國家衛(wèi)生計生委男性生殖健康重點(diǎn)實驗室，國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

有調(diào)查顯示，我國中老年人群中半數(shù)以上的人處于超重/肥胖狀態(tài)[1]。而肥胖對男性生殖的影響越來越受到關(guān)注[2-4]。研究表明，肥胖狀態(tài)往往伴隨著活性氧(ROS)的增加，Bakos等[5]發(fā)現(xiàn)高脂飲食導(dǎo)致大鼠精子DNA碎片化指數(shù)(DFI)增加同時精子活力下降。肥胖狀態(tài)可能通過增加機(jī)體氧化損傷水平導(dǎo)致生精障礙，然而目前關(guān)于肥胖對精子活力的影響尚未定論[6]。本研究通過高脂飲食構(gòu)建營養(yǎng)性肥胖的大鼠模型，研究肥胖對雄性大鼠生殖功能的影響，初步探討其氧化損傷相關(guān)的機(jī)制。

資料與方法

一、研究對象

6周齡SD雄性大鼠45只，體重(130.4±7.2)g，由北京維通利華提供[許可證號：SCXK(京)2012-0001]。

二、方法

1.構(gòu)建肥胖模型：45只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對照組(普通飼料)和肥胖組(高脂飲食：普通飼料73%、蔗糖10%、蛋黃粉5%、膽鹽0.5%、膽固醇1.5%、豬油10%)，自由進(jìn)食飲水，兩組除飲食外其他飼養(yǎng)條件均一致。喂養(yǎng)16周后，測定大鼠體重和身長。

2.肥胖判定標(biāo)準(zhǔn)：目前Lee指數(shù)是評價成年大鼠肥胖的常用數(shù)據(jù)。根據(jù)文獻(xiàn)報道高脂飲食喂養(yǎng)過程中動物可出現(xiàn)肥胖和肥胖抵抗，再結(jié)合Lee指數(shù)，本實驗中將肥胖組體重位于后25%位的大鼠去除[7]。因此，最終得到對照組(n=15)和肥胖組(n=22)。

3.計算身體指數(shù)：腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)，麻醉后取材。稱取內(nèi)臟脂肪、雙側(cè)睪丸和附睪的重量。計算相關(guān)參數(shù)：Lee指數(shù)=[體重(g)×103/身長(cm)]1/3；脂肪、睪丸和腎臟系數(shù)=器官重量/體重×100%。

4.代謝和內(nèi)分泌指標(biāo)測定：腹主動脈取血，4℃、2 400 r/min離心20 min分離血清，-80℃凍存。由酶聯(lián)免疫法(上海瀘峰化工)和放射免疫法(北京北方生物)測定，具體方法過程根據(jù)試劑盒中說明書操作，其中代謝指標(biāo)包括葡萄糖(GLU)、胰島素(INS)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、瘦素(Lep)，內(nèi)分泌指標(biāo)包括促性腺激素釋放激素GnRH、LH、FSH、總睪酮(TT)、雌二醇(E2)、性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)。依據(jù)公式計算：游離睪酮指數(shù)(FTI)=T/SHBG、睪酮分泌指數(shù)(TSI)=LH/T、游離睪酮(cFT)=[T-23.43cFT/SHBG-(T-23.43cFT)]×10-9mol/L。

5.精子參數(shù)：附睪尾經(jīng)37℃生理鹽水簡單洗滌，置于2 ml凍存管中剪碎再加入精子洗滌液中，37℃水浴箱中輕微震蕩孵育30 min。計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASS)計數(shù)精子濃度、活力和前向運(yùn)動。

6.生精細(xì)胞凋亡檢測：取大鼠睪丸，Bouins液固定、石蠟包埋后切片。依據(jù)試劑盒(羅氏，美國)操作說明測定睪丸組織生精細(xì)胞的凋亡情況，光學(xué)顯微鏡下觀察至少5個視野，計數(shù)500個生精細(xì)胞。凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/500×100%。

7.睪丸組織氧化應(yīng)激檢測：用玻璃勻漿管制作睪丸組織勻漿液，冰上進(jìn)行。4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)染色測定總蛋白濃度。參照試劑盒(南京建成生物)說明測定超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)濃度。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組大鼠身體指標(biāo)和代謝參數(shù)比較

喂養(yǎng)16周后，肥胖組大鼠體重、Lee指數(shù)、脂肪系數(shù)顯著升高而睪丸系數(shù)、腎臟系數(shù)顯著降低，血清中Lep、INS、TG顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組大鼠的身長、GLU和TC無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組大鼠生殖內(nèi)分泌激素結(jié)果比較

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，肥胖組大鼠GnRH、LH、TT、SHBG顯著降低而E2顯著升高，經(jīng)公式計算的FTI、cFT差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組大鼠血清FSH未見顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組大鼠附睪尾精子計數(shù)

統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，肥胖組大鼠附睪尾精子活力和前向運(yùn)動精子百分比顯著下降(P<0.01)；兩組大鼠的精子濃度無明顯差異(P>0.05)(表3)。

四、睪丸生精細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激的檢測

TUNEL法檢測肥胖組大鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組顯著增加(P<0.05)，肥胖組大鼠睪丸組織勻漿MDA濃度顯著升高而SOD活力顯著降低(P<0.05)(表4)。

表1 一般身體指標(biāo)和代謝參數(shù)(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

表2 生殖-內(nèi)分泌激素檢測結(jié)果(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 兩組精子參數(shù)的比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.01

表4 兩組AI、MDA和SOD比較(-±s)

注：MDA、SOD單位：每毫克蛋白的濃度、活力；與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

討 論

目前，肥胖對男性生殖的影響尚無定論。一項回顧性分析發(fā)現(xiàn)約1/3的文章報道肥胖會導(dǎo)致精子活力和精子濃度的下降[6]。近期也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，超重或者肥胖是男性少精子癥、無精子癥的高危因素[8-9]。鑒于人群中的研究容易受到其他因素(如生活習(xí)慣、藥物使用等)的干擾，因此本研究采用模式生物SD雄性大鼠為研究對象，條件可控。

本項研究的基礎(chǔ)是營養(yǎng)性肥胖大鼠模型的建立，與對照組相比，高脂飲食誘導(dǎo)大鼠的體重和Lee指數(shù)明顯增加，說明肥胖模型造模成功。另外內(nèi)臟脂肪也是判斷肥胖的重要體質(zhì)指標(biāo)，實驗中測定兩組大鼠腸系膜、腎周和睪周脂肪在內(nèi)的總脂肪重量及脂肪系數(shù)，高脂飲食組明顯高于普通飲食組。瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的抑制肥胖的一種蛋白，但是處于肥胖狀態(tài)時，機(jī)體不僅降低對自身瘦素的反應(yīng)，并對外源瘦素產(chǎn)生抗性[10]。此外，脂質(zhì)代謝紊亂也與肥胖關(guān)系密切。本研究中，肥胖組大鼠出現(xiàn)了高瘦素、高胰島素和高甘油三脂，說明肥胖大鼠出現(xiàn)瘦素抵抗和代謝紊亂。

有數(shù)據(jù)表明，雄激素低下與體重升高有一定的關(guān)聯(lián)，而嚴(yán)重肥胖可能導(dǎo)致機(jī)體下丘腦-垂體-性腺軸功能的紊亂[11]。一項生物信息學(xué)的研究結(jié)果顯示，肥胖狀態(tài)下機(jī)體生殖功能受到影響可能與類固醇激素、肽類激素代謝改變有重要關(guān)系[12]。睪酮是精子發(fā)生的關(guān)鍵激素，睪酮合成受LH激活的cAMP/PKA通路的調(diào)控，本實驗中睪酮水平的降低并伴隨著GnRH和LH的下降，我們推測肥胖抑制了HPT的整個通路。此外，肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞產(chǎn)生過多的芳香化酶，從而導(dǎo)致睪酮轉(zhuǎn)化E2增多，而E2的增加進(jìn)一步抑制HPT軸，進(jìn)一步抑制睪酮的合成和分泌。再者血清學(xué)分析顯示肥胖組大鼠SHBG水平顯著低于正常組大鼠，而性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)在雄激素運(yùn)輸過程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，這可能也是肥胖組大鼠睪酮低的原因之一。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體生長發(fā)育中正常的生理性死亡現(xiàn)象，正常大鼠睪丸中也存在著自發(fā)的生精細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Kun等[13]研究顯示促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2通過線粒體途徑在調(diào)控生精細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，二者比例失調(diào)可以激活下游caspase信號通路。細(xì)胞凋亡的顯著特點(diǎn)之一就是DNA碎片化，本研究采用TUNEL檢測睪丸組織生精細(xì)胞DNA損傷，結(jié)果顯示高脂飲食大鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組明顯增高，可能通過線粒體通路導(dǎo)致的生精細(xì)胞凋亡從而造成男性不育。

肥胖患者常伴隨ROS的增加[14]，氧化應(yīng)激水平升高與多種因素相關(guān)，其中線粒體功能改變起決定作用。在能量攝入過多的情況下導(dǎo)致機(jī)體高血糖水平使線粒體呼吸鏈活性增強(qiáng)，ROS增多。在正常生理條件下，氧化應(yīng)激處于動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體受到損傷時，其活性氧(ROS)就會增加，從而造成精子損傷[15]。精子膜富含多聚不飽和脂肪酸且抗氧化酶水平相對較低，容易受到活性氧的攻擊影響精子膜結(jié)構(gòu)。另外過多的ROS也會攻擊精子線粒體DNA，使精子線粒體功能受損，從而導(dǎo)致精子運(yùn)動能力的下降。本研究中高脂飲食的大鼠睪丸組織勻漿中SOD降低而MDA升高，說明肥胖組大鼠氧化應(yīng)激水平提高。這可能是本實驗中肥胖組精子活力和前向運(yùn)動精子百分比明顯下降的原因。此外，肥胖組大鼠的睪酮水平低下，而睪酮作為精子發(fā)生成熟的關(guān)鍵因素，也可能導(dǎo)致精子活力下降。另外也有研究顯示，高血脂水平可使附睪發(fā)生退行性的改[16]，高胰島素血癥和瘦素水平升高會引起精子線粒體功能受損，從而使精子活力下降[17-20]。由此可見，本研究中肥胖組大鼠精子活力下降與前述的代謝紊亂亦密切相關(guān)。

綜上所述，本研究中高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠出現(xiàn)代謝紊亂，下丘腦-垂體-睪丸性腺軸受到抑制，加之氧化損傷的增加導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡和精子活力下降。

致謝特別感謝中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院葛爭艷教授在構(gòu)建肥胖大鼠模型中的悉心指導(dǎo)。

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