唐飛，徐娟，邵明君

(浙江金華市中心醫(yī)院婦科，金華 321000)

眾所周知，人類內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)互相影響，雌激素(E2)通過影響細(xì)胞因子分泌而影響免疫功能[1]。本研究通過觀察小鼠雌激素受體水平及白細(xì)胞介素13(IL-13)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量在不同生理階段的變化，了解雌激素水平對(duì)小鼠免疫功能的影響，為臨床雌激素治療對(duì)絕經(jīng)婦女免疫功能的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雌性C57BL/6小鼠60只，其中2月齡40只，10月齡20只。由杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SYXK(浙)2016-0014)。

二、研究方法

1.小鼠發(fā)情間期、妊娠期和絕經(jīng)期的判定：采用陰道細(xì)胞學(xué)檢查，用小棉簽蘸取少量生理鹽水，擦取小鼠陰道內(nèi)分泌物順時(shí)針涂在載玻片上晾干，用95%酒精固定，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后于10×10倍光鏡下觀察。若顯微鏡下見有大量白細(xì)胞及少量有核細(xì)胞為發(fā)情間期[2]，全部是無核角化細(xì)胞或間有少量上皮細(xì)胞為發(fā)情期；發(fā)情期小鼠雌雄交配后，第2天觀察陰栓形成為妊娠；于妊娠12～15 d取標(biāo)本。13月齡小鼠，1天1次顯微鏡觀察陰道分泌物涂片，連續(xù)5 d內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則動(dòng)情周期者為絕經(jīng)期[3]。所有小鼠3月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前4 h采用Con A(10 mg/kg)尾靜脈注射。

2.實(shí)驗(yàn)分組和取材：2月齡小鼠隨機(jī)分為發(fā)情間期組、妊娠組，10月齡小鼠擬為自然絕經(jīng)組，每組20只。其中妊娠組、自然絕經(jīng)組為實(shí)驗(yàn)組，發(fā)情間期組為對(duì)照組。

3. RT-PCR檢測(cè)：新鮮取得小鼠脾臟組織100 mg，經(jīng)液氮冰凍后Trizol法提取總RNA用以待測(cè)IL-13 mRNA、TNF-α mRNA和ERα、ERβ mRNA，引物由上海生工生物有限公司合成，β-actin基因作為內(nèi)參基因(引物見表1)。電泳法檢測(cè)純度，定量后取5 μg經(jīng)特異性DNA酶消化后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)BD公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩晒舛縋CR反應(yīng)體系(美國(guó)BD公司)如下： 熒光標(biāo)記染料2×SYBR Green I Master Mix 5 μl，F(xiàn)orward primer 0.2 μl，Reverse primer 0.2 μl，小鼠脾臟 cDNA 1 μl，滅菌三蒸水補(bǔ)至總體積10 μl。條件為：95℃2 min；95℃ 15 s、60℃ 10 s、72℃15 s，循環(huán)數(shù)39；72℃ 5 min。將以上PCR擴(kuò)增試劑加入96 孔反應(yīng)板中，3 000 r/min離心3 min，然后放入Bio-Rad CFX-384 熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國(guó))反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用SDS 分析軟件(Applied Biosystems，美國(guó)) 進(jìn)行分析。

表1 各引物序列

4.ELISA檢測(cè)血清E2水平：取小鼠眼眶靜脈血經(jīng)離心后(3 000 r/min)取出血清，置于-80℃低溫冰箱保存，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)各組血清E2(上海生工生物有限公司)水平。具體操作過程如下：待測(cè)樣品孔加入樣本40 μl，然后各加入抗E2抗體10 μl、鏈霉親和素-HRP 50 μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60 min；每孔加滿洗滌液洗滌重復(fù)3次；每孔加入顯色劑100 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min；最后每孔加終止液50 μl終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算各組標(biāo)本E2含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組小鼠血清E2水平比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與發(fā)情間期(對(duì)照組)小鼠[(55.23±5.11) pmol/L]比較，妊娠組小鼠血清E2水平[(82.27±8.70) pmol/L]顯著升高，自然絕經(jīng)組小鼠血清E2水平[(23.52±4.46) pmol/L]顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)

二、各組小鼠脾臟IL-13、TNF-α、ERα、ERβ mRNA水平的變化

與發(fā)情間期(對(duì)照組)小鼠脾臟ERα mRNA水平(2.70±1.17)比較，妊娠組脾臟ERα mRNA水平(3.93±1.54) 顯著升高，自然絕經(jīng)ERα mRNA水平(1.15±0.71)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而三組之間ERβ mRNA水平無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

圖1 三組小鼠的血清E2水平

圖2 三組小鼠脾臟ERα、ERβ mRNA的表達(dá)水平

與妊娠組小鼠比較，發(fā)情間期組和自然絕經(jīng)組小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA相對(duì)水平顯著升高，在自然絕經(jīng)組小鼠脾臟表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 三組小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA的表達(dá)水平

討 論

性激素補(bǔ)充治療(Hormone Replacement Therapy，HRT)對(duì)改善圍絕經(jīng)期癥狀、預(yù)防骨質(zhì)疏松和心血管疾病等的有益作用已毋庸置疑。理論上雌激素(E2)一直被認(rèn)為是潛在致癌促進(jìn)劑[3]，通過影響細(xì)胞增殖分化而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。是否增加與性激素依賴有關(guān)的惡性腫瘤，以及此類患者在HRT 后是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)等問題，長(zhǎng)期以來存在廣泛爭(zhēng)議，相關(guān)研究表明性激素與婦女免疫功能關(guān)系密切，可能通過免疫系統(tǒng)影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[4-7]。

TNF-α是由激活的單核巨噬細(xì)胞系列合成和釋放的一種蛋白質(zhì)，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及組織更新改建起著重要調(diào)節(jié)作用。TNF-α是重要的內(nèi)源性炎癥性細(xì)胞因子，同時(shí)還是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和代謝過程的多功能細(xì)胞因子[8]。

人類IL-13具有多功能的作用，應(yīng)答細(xì)胞包括單核吞噬細(xì)胞、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。尤其IL-13通過激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞抑制促炎因子的合成，抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、MIP-1、IFN-q、TNF-α和G-CSF等)。IL-13具有調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞活性的功能[9]，IL-13激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過誘導(dǎo)環(huán)氧化酶-2下調(diào)前列腺素。

機(jī)體內(nèi)環(huán)境是復(fù)雜的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，E2需與受體結(jié)合后才能發(fā)揮作用，因此不同的E2效應(yīng)除了自身濃度差異以外，還與組織細(xì)胞上受體亞型及功能狀態(tài)不同抑或其他細(xì)胞因子的間接效應(yīng)有關(guān)[10]。本研究通過檢測(cè)不同生理階段小鼠中E2水平，ERα、ERβ mRNA 表達(dá)及多種免疫學(xué)指標(biāo)、細(xì)胞因子的水平，以觀察體內(nèi)生理水平E2及相應(yīng)受體功能狀態(tài)對(duì)是否對(duì)各項(xiàng)免疫指標(biāo)產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)妊娠組血清E2水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，自然絕經(jīng)組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，妊娠組血清ERα mRNA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，自然絕經(jīng)ERα mRNA明顯組低于對(duì)照組(P<0.05)；而三組ERβ mRNA水平無明顯差異(P>0.05)，提示E2與ERα結(jié)合發(fā)揮作用，與Pierdominici等[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

細(xì)胞因子是調(diào)控蛋白質(zhì)，由不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生，經(jīng)自分泌，內(nèi)分泌和旁分泌形式參與對(duì)外界刺激的反應(yīng)。絕經(jīng)后E2的驟然下降影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12-13]。夏賢等[6-7]發(fā)現(xiàn)對(duì)絕經(jīng)婦女補(bǔ)充E2能明顯提高T 細(xì)胞表面ERα表達(dá)，增強(qiáng)CD4+T 細(xì)胞作用，達(dá)到免疫平衡狀態(tài)。TNF-α、IL-13是機(jī)體內(nèi)兩種重要的多功能細(xì)胞因子，主要由激活的巨噬細(xì)胞分泌，兩者相互促進(jìn)，并與其它細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)。絕經(jīng)期婦女體內(nèi)IL-13、TNF-α水平升高，并且機(jī)體對(duì)此類細(xì)胞因子反應(yīng)亦增加，誘導(dǎo)婦女冠心病發(fā)生[14]，加速老齡化婦女骨質(zhì)丟失，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA相對(duì)水平表達(dá)發(fā)情間期組較妊娠組水平高(P<0.05)，三組小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA相對(duì)水平在自然絕經(jīng)組表達(dá)最高(P<0.05)，提示當(dāng)小鼠處于自然絕經(jīng)期，E2下降，IL-13、TNF-α mRNA因子相對(duì)水平分泌升高，而年輕時(shí)期IL-13、TNF-α mRNA因子水平分泌降低，提示E2對(duì)IL-13、TNF-α因子水平的作用可能有影響，E2是否對(duì)機(jī)體其他免疫因子的影響及其機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Karpuzoglu E，Phillips RRJ，Ansar-Ahmed S. IFN-γ-Inducing transcription factor，T-Bet is upregulated by estrogen in murine splenocytes： role of IL-27 but not IL-12[J]. Mol Immunol，2007，44： 1808-1814.

[2] Martins RR，Pereira NM，Silva TM. Liquid-base cytology： a new method for oestral cycle study in Wistar’s rats[J]. Acta Cir Bras，2005，20：78-81.

[3] Wang JM，Hou X，Adeosun S，et al. A dominant negative ERβ splice variant determines the effectiveness of early or late estrogen therapy after ovariectomy in rats[J/OL]. PLoS One，2012，7：e33493.

[4] Pierdominici M，Maselli A，Colasanti T，et al. Estrogen receptor profiles in human peripheral blood lymphocytes[J]. Immunol Lett，2010，132：79-85.

[5] Erlandsson MC，Jonsson CA，Islander U，et al. Oestrogen receptor specificity in oestradiol-mediated effects on B lymphopoiesis and immunoglobulin production in male mice[J].Immunology，2003，108：346-351.

[6] 夏賢，張紹芬，劉瑞梓，等.口服和經(jīng)皮膚途徑雌激素替代治療對(duì)手術(shù)絕經(jīng)婦女圍絕經(jīng)癥狀和T 淋巴細(xì)胞雌激素受體亞型表達(dá)的影響[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18：101-106.

[7] Xia X，Zhang S，Yu Y，et al. Effects of estrogen replacement therapy on estrogen receptor expression and immunoregulatory cytokine secretion in surgically induced menopausal women[J].J Reprod Immunol，2009，81： 89-96.

[8] 黃志勇，張軍. 高?；颊咝g(shù)后TNFα及IL-6 水平變化與感染性并發(fā)癥及MODS關(guān)系的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17：486-487.

[9] Endo T，Ogushi F，Sone S. LPS-dependent cyclooxygenase-2 induction in human monocytes is down-regulated by IL-13，but not IFN-gamma [J]. J Immunol，1996，156：2240-2246.

[10] Ito I，Hanyu A，Wayama M，et al. Estrogen inhibits transforming growth factor betasignaling by promoting Smad2/3 degradation[J]. J Biol Chem，2010，285：14747-14755.

[11] Pierdominici M，Maselli A，Colasanti T. Estrogen receptor profiles in human peripheral blood lymphocytes[J]. Immunol Lett，2010，132：79-85.

[12] Kamada M，Irahara M，Maegawa M，et al. Postmenopausal changes in serum cytokine levels and hormone replacement therapy[J]. Am J Obstet Gynecol，2001，184： 309-313.

[13] 沈蘇南，費(fèi)捷，肖杭，等.17β-雌二醇對(duì)未成熟雌性大鼠體液免疫及胸腺內(nèi)雌激素受體的影響[J].上海免疫學(xué)雜志，2002，22： 193-196.

[14] 馬麗萍，張國(guó)元，秦永文，等.17β-雌二醇對(duì)白細(xì)胞介素6 腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響[J].心肺血管病雜志，2002，21： 48-50.

[15] 何勇，劉樹琴.IL-6、TNF-α與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌分冊(cè)，2003，23： 130-132.