程思杰，趙娜娜，嚴 錦，王瑞蘭，余靈祥，肖朝輝，雷光林，張培瑞，王兆海，張紹庚，楊鵬輝

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內每年大約有74萬新增HCC病例，同時又有70萬HCC死亡病例，其中大約50%發(fā)生在中國[1-2]。由于高發(fā)病率和高病死率，HCC在世界范圍內尤為被重視，而我國的HCC發(fā)病率及病死率也呈逐年上升趨勢，高居各種惡性腫瘤相關死亡原因的總體第2位[2-3]，嚴重危害人類健康。HCC的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的生物學過程。已有研究表明HCC的發(fā)生發(fā)展與HBV、HCV感染以及感染引起的相關通路變化相關[4-5]；也與多種干細胞生長因子的異常表達引起的信號通路變化密切相關[6-7]。然而，HCC發(fā)生發(fā)展及轉移的分子生物學機制至今尚未明確。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一類不編碼蛋白或只能編碼短肽，轉錄本長度一般超過200 nt的非編碼RNA分子，起初被認為是轉錄過程中的副產物，無任何生物學功能[8-9]。但是越來越多的研究顯示，LncRNA在基因轉錄翻譯、表觀遺傳、細胞分化等生命活動中發(fā)揮了重要的調控作用，并且在多種腫瘤中存在異常表達，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移等過程[10-12]，有望成為新的潛在腫瘤標志物和藥物靶標，為腫瘤的診斷和預后提供新的研究思路[13-15]。此外，特異性表達的LncRNA譜可以將癌組織和癌旁組織進行準確判別[16]。因此，本研究基于人類LncRNA公共數(shù)據(jù)庫GSE55191基因數(shù)據(jù)，檢測了LncRNA LOC728290在HCC患者中配對（癌組織、癌旁組織）表達水平差異，并進一步探討LncRNA LOC728290的表達水平與患者臨床病理特征、術后無復發(fā)生存時間的關系，為HCC患者早期診斷及預后提供參考。

1 對象與方法

1.1 標本來源 選取2013年10月—2016年12月于解放軍第三〇二醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術患者65例，患者術前均未接受化療、放療等輔助治療，標本經病理分析證實均為HCC。對照組標本來自于同一患者的癌旁組織（距離手術切緣至少3 cm），術后病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細胞。所有標本在離體后立即放入液氮中保存。腫瘤分化程度依據(jù)Edmondson-Steiner分級標準確定，腫瘤分期按美國腫瘤研究聯(lián)合委員會2010年發(fā)布的第7版分期系統(tǒng)的標準確定。

1.2 儀器與試劑 LncRNA LOC728290及GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司設計及合成；RNA提取試劑Trizol購自美國Life Technologies公司；RNA反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）試劑盒均購自全式金生物科技有限公司；生物分光光度儀購自美國Thermo公司；qRT-PCR儀購自美國Applid Biosystems公司。LncRNA LOC728290引物序列為：5′-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3′（正向引物）；5′-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3′（反向引物）。GAPDH：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（正向引物）；5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′（反向引物）。

1.3 RNA的提取 取100 mg液氮凍存的肝組織并加1 ml Trizol，用組織勻漿儀研磨，研磨充分后抽提RNA；RNA含量和純度采用核酸蛋白定量檢測儀檢測，RNA純度的判斷采用A260/A280的比值，當該比值為1.8～2.0時認為RNA樣品的純度合格。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.4 RT-PCR及qRT-PCR 按照反轉錄說明書將所提取組織標本RNA反轉錄成cDNA。按照SYBR Green說明書配制qRT-PCR反應體系。取cDNA進行qRT-PCR，反應條件如下：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火，進行40個循環(huán)，每個樣品設3個復孔并進行3次生物學重復，每次都將待測樣品及內參同時進行qRT-PCR，基于2-△△Ct的方法進行相對定量分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Wilcoxon秩和檢驗比較LncRNA LOC728290在癌組織和配對癌旁組織的表達水平；LncRNA LOC728290高表達組與低表達組患者臨床病理特征的比較采用χ2檢驗；臨床病理差異患者的LncRNA LOC728290表達水平比較采用Mann-Whitney秩和檢驗；總體生存率采用Kaplan-Meier生存分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織及配對癌旁組織中的表達水平 通過qRT-PCR分別檢測65例HCC患者癌組織和配對癌旁組織中LncRNA LOC728290的表達。Wilcoxon秩和檢驗結果表明，LncRNA LOC728290在癌組織中表達量顯著低于配對癌旁組織（t=12.540，P=0.001）（圖1A）；其中54例HCC患者（83.0%）LncRNA LOC728290在癌組織中的表達水平較配對癌旁組織下調（圖1B）。

圖1 LncRNA LOC728290在HCC患者中癌組織及配對癌旁組織相對表達水平A.LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織和配對癌旁組織中的表達水平（n=65）；B.LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織較配對癌旁組織的相對表達水平，正數(shù)代表表達量升高，負數(shù)則代表降低Figure 1 Relative expression level of LncRNA LOC728290 in tumor tissues and its paired adjacent tissues of HCC patients

2.2 HCC組織LncRNA LOC728290表達量與患者臨床特征的關系 根據(jù)HCC患者癌組織中LncRNA LOC728290相對表達量的中位數(shù)將65例標本分為LncRNA LOC728290高表達組（n=32）和低表達組（n=33）[17]，通過比較2組患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC728290的表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否有門靜脈癌栓及病理分級之間差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。而LncRNA LOC728290的表達與患者AFP水平及患者是否存在微脈管浸潤差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表1）。進一步對AFP水平≥20 ng/m（ln=39）和AFP水平＜20 ng/m（ln=26）標本中LncRNA LOC728290表達量比較分析顯示：血清AFP≥20 ng/ml的患者癌組織中的LncRNA LOC728290的表達水平較血清AFP＜20 ng/ml組患者顯著降低（t=2.421，P=0.021）（圖2A）。對有微脈管浸潤的HCC患者（n=47）和無微脈管浸潤的HCC患者（n=18）標本中LOC728290的表達量檢測結果顯示：微脈管浸潤的HCC患者LncRNA LOC728290顯著低表達（t=2.021，P=0.040）（圖2B）。

2.3 HCC患者癌組織中LncRNA LOC728290表達水平與患者預后的關系 結合臨床患者隨訪信息，分析LncRNA LOC728290的表達水平與HCC患者（n=65）術后無復發(fā)生存率的關系發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC728290表達水平低的HCC患者無復發(fā)生存率較其表達水平高的HCC患者明顯降低，2者差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.047）（圖3）。

3 討 論

HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率也逐年攀升[18]。越來越多的研究表明LncRNA的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉移過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[19-21]。HCC的發(fā)生發(fā)展機制復雜，已有研究表明LncRNA H19、MALAT1和HULC與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[22-24]，但其具體作用機制尚不明確?；诖耍狙芯渴紫葘?shù)據(jù)庫中HCC的LncRNA的表達情況進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA LOC728290在HCC中顯著低表達，具有成為HCC患者預后標志物的潛力。本研究進一步證實LncRNA LOC728290在65例HCC患者癌組織中較配對癌旁組織表達顯著下調；同時LncRNA LOC728290表達水平低的HCC患者無復發(fā)生存時間較表達水平高的患者顯著降低，推測LncRNA LOC728290可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程。由于肝組織的復雜性，HCC患者合并HBV、HCV感染與否，是否具有肝纖維化、肝硬化，門靜脈癌栓或微脈管浸潤等，必然對應不同的細胞內信號通路或腫瘤微環(huán)境的改變。因此，LncRNA LOC728290在HCC中表達下降的機制與HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制還需要后續(xù)的研究來證實。

表1 HCC組織中LncRNA LOC728290高表達組與低表達組臨床指標比較（n=65）Table 1 Comparison of clinical indexes of LncRNA LOC728290 between the high expression group and the low expression group in HCC tissues (n=65)

近年來，隨著直接抗病毒藥物的發(fā)展與應用，即使在不聯(lián)合使用干擾素的情況下，其對慢性肝炎尤其是HCV感染引起的慢性肝炎也取得了良好的治療效果。但直接抗病毒藥物對肝硬化患者和IL-28B抗性基因型患者治療效果卻不盡如人意，患者發(fā)生HCC的幾率仍維持在較高水平[25]，因此探尋新的標志物或潛在靶標的任務仍然非常迫切。近年來，研究表明多種LncRNA（HOTAIR、H19、ZEB1-AS1等）參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望作為疾病潛在預后指標[26-28]。本研究，統(tǒng)計分析了LncRNA LOC728290的表達水平與臨床病理資料的相關性，發(fā)現(xiàn)LncRNA LOC728290的表達與患者AFP水平是否＞20 ng/ml及患者是否存在微脈管浸潤有關差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），血清AFP在肝癌的診斷中發(fā)揮著重要的作用[29-30]，推測LncRNA LOC728290可能是HCC發(fā)生的一個重要標志物；此外還發(fā)現(xiàn)其表達水平與患者微脈管浸潤具有相關性，而微脈管浸潤及門靜脈癌栓是HCC肝外轉移的主要途徑[31-32]，由此揭示LncRNA LOC728290在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具體的生物學功能、調控機制還有待深入探究。然而，LncRNA LOC728290的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分期及是否合并肝硬化等其他臨床病理指標的差異無統(tǒng)計學意義，可能與目前臨床患者樣本量較小、腫瘤異質性等因素有關，還須要進一步擴大樣本量驗證該結論。另外，LncRNA LOC728290在不同HCC細胞系的差異表達，其相互作用的靶基因及信號通路以及其在體外細胞模型和體內荷瘤裸鼠發(fā)揮的具體功能等還有待進一步研究，以揭示其在HCC發(fā)生發(fā)展中的具體調控機制；并且進一步隨訪完善患者總生存時間與疾病預后關系，以期使LncRNA LOC728290成為HCC潛在的臨床早期診斷、判斷疾病預后的候選靶標。

圖2 LncRNA LOC728290在AFP水平、有/無微脈管浸潤HCC患者癌組織中的表達量差異A.LncRNA LOC728290在不同AFP水平組中的表達；B.LncRNA LOC728290在有/無微脈管浸潤患者癌組織的表達Figure 2 Differential expression levels of LncRNA LOC728290 in HCC patients with different levels of serum AFP and patients with or without microvascular invasion

圖3 不同LncRNA LOC728290的表達水平與HCC患者術后無復發(fā)生存曲線Figure 3 Correlations between LncRNA LOC728290 expression level and recurrence-free survival of HCC patients

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