覃黎葵，張奉學(xué)，黃笑娟，宋鴻，龔文亮

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院，廣東 廣州 511495；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 511006

呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的小兒呼吸系統(tǒng)疾病是世界范圍的一個主要公共健康問題[1]。RSV感染是導(dǎo)致嬰幼兒下呼吸道感染、細支氣管炎和肺炎最主要的病原體，也是世界范圍內(nèi)兒童流行性呼吸道疾病的主要感染因素之一[2～3]。目前仍沒有令人信服的安全的針對該病毒的疫苗，也沒有行之有效的抗病毒治療手段[4～5]。在長期的實踐中，中醫(yī)在防治RSV方面積累了豐富的經(jīng)驗?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)銀翹散有抗菌、抗病毒、抗炎的作用[6]。本研究建立RSV感染小鼠呼吸系統(tǒng)動物模型，通過對肺指數(shù)進行測定，HE染色觀察肺組織和鼻黏膜組織的炎性浸潤等病理形態(tài)學(xué)改變，檢測炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)的表達，實時熒光定量PCR和Western blot檢測肺組織NALP3炎性體(NALP3)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1(caspase-1)的表達，從體內(nèi)水平分析銀翹散治療RSV感染的療效及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞和動物 健康BALB/c小鼠54只，6～8周齡，體質(zhì)量為18～20 g，雌雄各半，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2008A023。HEp-2細胞系(人喉癌上皮細胞)購自中科院上海細胞庫。RSV-Long毒株購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所。實驗在暨南大學(xué)動物實驗中心進行。

1.1.2 實驗藥物 銀翹散配方：連翹、金銀花各30g，苦桔梗、牛蒡子、薄荷各18 g，竹葉、荊芥穗各12 g，淡豆豉、蘆根、生甘草各15 g，中藥飲片均購于北京同仁堂。金銀花、桔梗粉碎成細粉，過五號篩，為成分Ⅰ；薄荷、荊芥提取揮發(fā)油，為成分Ⅱ，蒸餾后的水溶液另用容器收集，為成分Ⅲ；藥渣與余6味藥加10倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過，合并濾液，為成分Ⅳ。合并成分Ⅰ～Ⅳ，混勾，制成2.42 g(生藥)/mL藥液，冷凍干燥，3天后回收71.34 g褐色粉末，置-20℃保存?zhèn)溆?。給藥時用蒸餾水配制成相應(yīng)的濃度。利巴韋林片購自江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號1302009，給藥時用蒸餾水配制成相應(yīng)的濃度。

1.1.3 主要試劑及儀器 高糖型DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(FBS，Hyclone)；瓊脂糖(上海生化試劑公司)；Trizol(Takara)。RT-PCR試劑，DBI公司產(chǎn)品；DEPC，美國Sigma公司產(chǎn)品；RNasin，美國Promega公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，DBI公司產(chǎn)品?？筃ALP3抗體、抗ASC抗體和抗caspase-1抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司；二抗HRP Goatanti-RabbitIgG 購 自 BOSTER。 Tris-base、Glycine、SDS(十二烷基硫酸鈉)，上海生工生物工程有限公司。酶聯(lián)免疫吸試劑盒(ELISA)購于TaKaRa公司，丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、苯甲基磺酰氟、溴汾藍購于Genebase。BCA蛋白濃度測定試劑盒、過硫酸銨、TWEEN-20(吐溫)、二硫代蘇糖醇、NaCl購自威佳科技。BSA購于Amresco；四甲基乙二胺購自晶欣生物科技有限公司；蛋白定量試劑盒購于Thermo；PVDF膜購于Millipore；醫(yī)用X-光片，廣西巨星醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、建模及干預(yù) BALB/c小鼠隨機分為6組，每組9只，分別是正常組、模型組、銀翹散高劑量組、銀翹散中劑量組、銀翹散低劑量組、利巴韋林組。銀翹散高、中、低劑量組分別給予 600 mg/(kg·d)、300 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)銀翹散灌胃，利巴韋林組給予150 mg/(kg·d)利巴韋林灌胃，給藥體積均為0.1 mL/10 g。各組小鼠用乙醚淺麻后，以濃度TCID50(TCID50=10-7.5/mL)RSV病毒液50 μL滴鼻感染小鼠。銀翹散高、中、低劑量組、利巴韋林組于感染前1天開始灌胃給藥，連續(xù)5天，正常組、模型組給予等容積蒸餾水灌胃。

1.2.2 肺重及肺指數(shù)的測定 感染后第5天，稱量每只小鼠的體質(zhì)量并記錄，殺死并解剖小鼠，取出鼠肺，詳細記錄病變程度，將鼠肺放在盛有生理鹽水的平碟中洗2次，用吸水紙吸干表面水分，稱量肺重，計算出肺指數(shù)，肺指數(shù)=(小鼠肺重/小鼠體質(zhì)量)×100%。

1.2.3 肺組織病理檢查 取部分肺組織放入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，取鼻黏膜及部分肺組織放入4%甲醛固定。常規(guī)病理組織脫水后，石蠟包埋切片并行HE染色，鏡下鏡檢拍照檢查病理變化情況。1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6取肺泡灌洗液，使用ELISA檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

1.2.5 qPCR法檢測 NALP3、ASC和 caspase-1 mRNA的表達 取肺組織，qPCR檢測NALP3、ASC和caspase-1的表達。利用Trizol規(guī)范提取組織RNA，-80℃儲存?zhèn)溆?。計算RNA的純度及濃度，以2 μg總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，收集備用。根據(jù)DBI BestarRSybr Green qPCRmasterMix的說明書配制qPCR擴增的反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃20 s，40個循環(huán)。融解曲線分析：溫度62℃～95℃。每個樣重復(fù)3次，使用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行熒光定量PCR實驗。引物序列見表1。

結(jié)果按照2-△△Ct方法來計算，利用qPCR技術(shù)通過2-△△Ct方法分析相對基因表達差異。其中，△Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)的平均值±標準偏差；△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)的平均值±標準偏差(若無參照樣品則選擇Ct最大的樣品為參照進行計算)；相對樣品初始模板量=(2-△△Ct)的平均值±標準偏差。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot檢測NALP3、ASC和caspase-1蛋白的表達 取肺組織檢測NALP3、ASC和caspase-1蛋白的表達。配制相應(yīng)試劑，取50～100 mg肺組織樣本提取總蛋白，置于-80℃冰箱保存，繪制標準曲線，根據(jù)所測樣品的吸光值及標準曲線回歸方程，計算總蛋白含量。將目的蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜和孵育抗體，接著將抗體孵育后的PVDF膜蛋白面朝上放在保鮮膜上，滴加適量混合液，包好，進行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，最后將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Image-ProPlus 6.0)分析條帶凈光密度值。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以(x±s)表示，多組之間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，采用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺指數(shù)比較 見表2。與正常組比較，模型組小鼠肺指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀翹散高、中、低劑量組、利巴韋林組小鼠肺指數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與利巴韋林組比較，銀翹散低劑量組小鼠肺指數(shù)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組小鼠肺指數(shù)比較(x±s)

2.2 各組小鼠鼻黏膜病理形態(tài)結(jié)果比較 見圖1。正常組小鼠表現(xiàn)為纖毛排列十分整齊，而且纖毛粗細均勻一致，并未觀測到明顯的脫落缺失現(xiàn)象，在固有層沒有檢測到明顯嗜酸性粒細胞浸潤。模型組可見大量的纖毛結(jié)構(gòu)脫落，排列散亂，同時組織嚴重水腫，并且發(fā)現(xiàn)鼻黏膜充血十分嚴重，黏膜上皮下的固有層有明顯的嗜酸性粒細胞浸潤。與模型組比較，利巴韋林組可見黏膜上皮細胞受損顯著減輕，組織水腫和鼻黏膜充血明顯減輕，嗜酸性粒細胞的浸潤顯著減少。銀翹散低劑量組可見組織嚴重水腫，鼻黏膜充血現(xiàn)象略有減少，黏膜上皮下固有層出現(xiàn)嗜酸性粒細胞浸潤；銀翹散中劑量組部分可見少量黏膜上皮細胞脫落，鼻黏膜充血現(xiàn)象明顯減輕；銀翹散高劑量組部分可見少量上皮細胞脫落，鼻黏膜充血現(xiàn)象明顯減輕，組織水腫及嗜酸粒細胞浸潤顯著減少。

圖1 各組小鼠鼻黏膜病理形態(tài)結(jié)果比較 (×400)

2.3 各組小鼠肺組織病理形態(tài)結(jié)果比較 見圖2。正常組小鼠肺組織支氣管與細支氣管周圍無炎性細胞浸潤，管腔內(nèi)無炎性細胞及其他分泌物滲出；肺泡隔厚度均勻，未見增粗增厚及肺實變表現(xiàn)，未見毛細血管擴張充血、出血及炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無水腫液及炎性細胞等異物。模型組小鼠肺組織支氣管與細支氣管周圍大量淋巴細胞浸潤，管腔內(nèi)大量單核細胞與淋巴細胞及其他分泌物滲出；肺泡隔顯著增寬，薄厚不均，部分表現(xiàn)有肺泡壁毛細血管擴張充血、出血，大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，存在肺實變表現(xiàn)，肺泡腔狹窄或完全被炎性細胞填塞，腔內(nèi)可見紅細胞及淡紅色透明水腫液。與模型組比較，利巴韋林組肺泡間隔明顯變薄，間質(zhì)血管擴張、充血以及水腫現(xiàn)象顯著減輕，炎性細胞的滲出明顯減少。銀翹散低劑量組肺泡間隔明顯變薄，血管擴張充血略有減輕。銀翹散中劑量組病變肺組織減少，病變不明顯。銀翹散高劑量組肺泡腔的大小十分均勻，肺泡壁完整沒有缺失，腔內(nèi)可見少量紅細胞及淡紅色透明水腫液。

圖2 各組小鼠肺組織病理形態(tài)結(jié)果比較 (×100)

2.4 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達水平比較見表3。與正常組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀翹散高、中、低劑量組、利巴韋林組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與利巴韋林組比較，銀翹散中劑量組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β表達較高，銀翹散低劑量組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6表達較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達水平比較(x±s)pg/mL

2.5 各組小鼠肺組織NALP3 mRNA及蛋白表達水平比較 見表4、圖3。與正常組比較，模型組小鼠肺組織NALP3mRNA、NALP3蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀翹散高、中、低劑量組、利巴韋林組小鼠肺組織NALP3 mRNA、NALP3蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與利巴韋林組比較，銀翹散低劑量組小鼠肺組織NALP3 mRNA、NALP3蛋白表達較高，銀翹散中劑量組小鼠肺組織NALP3 mRNA表達較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.6 各組小鼠肺組織ASC mRNA及蛋白表達水平比較 見表5、圖4。與正常組比較，模型組小鼠肺組織ASCmRNA、ASC蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀翹散高、中、低劑量組、利巴韋林組小鼠肺組織ASC mRNA、ASC蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與利巴韋林組比較，銀翹散低劑量組小鼠肺組織ASC mRNA、ASC蛋白表達較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.7 各組小鼠肺組織caspase-1 mRNA及蛋白表達水平比較 見表6、圖5。與正常組比較，模型組小鼠肺組織caspase-1 mRNA、caspase-1蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀翹散高、中、低劑量組、利巴韋林組小鼠肺組織caspase-1 mRNA、caspase-1蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與利巴韋林組比較，銀

表4 各組小鼠肺組織NALP3 mRNA及蛋白表達水平比較(x±s)

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與利巴韋林組比較，③P＜0.05翹散中劑量組小鼠肺組織caspase-1 mRNA表達較高，銀翹散低劑量組小鼠肺組織caspase-1 mRNA和蛋白表達較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 各組小鼠肺組織NALP3蛋白表達結(jié)果

表5 各組小鼠肺組織ASC mRNA及蛋白表達水平比較(x±s)

圖4 各組小鼠肺組織ASC蛋白表達結(jié)果

表6 各組小鼠肺組織caspase-1 mRNA及蛋白表達水平比較(x±s)

圖5 各組小鼠肺組織caspase-1蛋白表達結(jié)果

3 討論

目前可供臨床選用治療RSV的藥物較少，一直以來，西藥方面治療RSV感染的藥物主要有抗病毒藥物、支氣管擴張劑、激素類抗炎藥和免疫調(diào)節(jié)劑等，但是這些藥物都存在比較嚴重的毒副作用。與西藥相比，中藥的毒副作用小，藥源豐富，可通過調(diào)整機體的免疫狀態(tài)來增強機體抵抗流感病毒的免疫力。

銀翹散為中藥復(fù)方，是中醫(yī)辛涼解表法的代表方，是臨床辨證治療風(fēng)熱型流感的主要方劑；對流行性感冒、肺炎、支氣管炎、扁桃體炎、腮腺炎等屬于中醫(yī)溫?zé)岵》懂牭牟《拘愿腥炯膊∮星袑嵂熜?。其配方由連翹、金銀花、桔梗、薄荷、竹葉、生甘草、荊芥穗、淡豆豉、牛蒡子、蘆根10味藥物組成，其中金銀花、連翹既有辛涼透邪、清熱之功，又具芳香辟穢解毒之效；薄荷、牛蒡子辛涼，疏風(fēng)清熱而利咽喉。荊芥穗、淡豆豉辛溫，助君藥開皮毛而逐邪，芳香辟穢。竹葉可清上焦熱；蘆根可清熱生津；桔?？尚沃箍取８什菁瓤烧{(diào)和諸藥，護胃安中，又可合桔梗清利咽喉。

RSV感染常常導(dǎo)致免疫損傷和炎癥的出現(xiàn)。在活化炎癥因子的過程中，NALP3炎性體有不可或缺的作用。NALP3炎性體是NOD樣受體蛋白家族成員，是體內(nèi)免疫系統(tǒng)對病原體的感受器，可識別病原體并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。NALP3炎性體由NOD樣受體家族成員3、ASC、以及半胱天冬酶caspase-1組成。當(dāng)配體與NALP3結(jié)合后促進炎癥小體的形成，并對caspase-1進行自身激活，導(dǎo)致IL-1β和IL-18等各種炎性因子的成熟及分泌，引起各種免疫炎癥反應(yīng)[6]。

肺指數(shù)是指肺重占機體體質(zhì)量的百分率，通常以肺指數(shù)值的大小表示肺炎性疾病病變的嚴重程度，用肺指數(shù)可以作為藥物作用的檢驗指標，發(fā)揮定量的作用，客觀的反應(yīng)肺病變的程度。HE染色觀察鼻黏膜組織上皮細胞受損程度、水腫程度以及嗜酸性粒細胞浸潤能夠間接表明銀翹散的治療效果。同時采用HE染色觀測肺組織病理形態(tài)變化，觀察肺組織肺泡形態(tài)、間質(zhì)血管、水腫以及炎性細胞滲出情況可以間接判斷銀翹散的治療效果。RSV感染能夠?qū)е卵装Y的發(fā)生，導(dǎo)致一些因子如細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、細胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)等發(fā)揮宿主防御功能，啟動抗病毒和炎癥反應(yīng)[7～10]，所以檢測炎癥因子可以間接反映銀翹散的治療效果。另外，研究表明[6]，NALP3炎癥小體是細胞內(nèi)負責(zé)免疫和炎癥過程的蛋白復(fù)合物，其由NALP3、ASC及caspase-1組成，NALP3、ASC和caspase-1的表達和炎癥因子的表達密切相關(guān)，肺組織NALP3、ASC和caspase-1表達水平可以作為銀翹散療效的間接指標。

采用銀翹散治療RSV感染小鼠可以降低肺指數(shù)，抑制NALP3、ASC和caspase-1的表達水平，從而抑制炎癥小體NALP3的形成，降低IL-1β、TNF-α、IL-6的表達，顯著減輕鼻黏膜上皮細胞受損情況、組織水腫以及鼻黏膜充血的程度，顯著減少嗜酸性粒細胞浸潤以及阻止肺泡間隔變薄，減輕間質(zhì)血管擴張、充血、水腫，減少炎性細胞滲出。銀翹散高、中劑量組的治療效果和利巴韋林相似，強于銀翹散低劑量組，所以建議采用高、中劑量銀翹散進行RSV感染治療。

本研究選擇小鼠建立RSV感染模型，雖然技術(shù)成熟且應(yīng)用廣泛，但由于其缺乏臨床癥狀的表達且為慢效應(yīng)模型，加之小鼠并不是RSV感染的唯一宿主，炎癥反應(yīng)可能不顯著，影響藥物效果的觀察，因此具有一定的局限性，在今后的研究中需尋求更理想、更穩(wěn)定、更可靠的模型。中藥具有成分復(fù)雜、副作用少、藥源豐富、價格低廉且作用靶點多的特點，本研究重視病毒-機體-中藥三者的關(guān)系，通過動物實驗評價了銀翹散對RSV感染所致呼吸系統(tǒng)炎癥的改善作用，但關(guān)于該藥的有效成分以及藥理活性研究還有待考察。下一步課題組將應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)手段深入研究銀翹散抗RSV的主要活性成分，并通過臨床實驗進一步探討銀翹散抗RSV感染相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用價值，為中藥走向世界提供更為科學(xué)的理論依據(jù)。

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