符卓韜，孟聰，符林春

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 2.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510130 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

由于工作壓力、環(huán)境污染的影響，適齡而受生育問(wèn)題困擾的人數(shù)呈逐年上升的趨勢(shì)。許多不育患者經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)了性激素的異常，同時(shí)伴隨精子密度及活動(dòng)率的下降。雖然十一酸睪酮等藥物已廣泛應(yīng)用于低睪酮血癥等性激素原因?qū)е碌牟挥?，但是長(zhǎng)期用藥可能出現(xiàn)肝腎功能損害、前列腺增生、高血壓、頭痛等不良反應(yīng)，同時(shí)停藥后常出現(xiàn)病情反復(fù)，依從性較難保證，且對(duì)部分患者治療無(wú)明顯臨床療效。羊藿巴戟口服液為國(guó)藥準(zhǔn)字產(chǎn)品，由《辨證錄》(卷十)的補(bǔ)天育麟丹加減而來(lái)，主治男子心腎兩虛，陽(yáng)痿早泄，精液甚薄，不能生育。羊藿巴戟口服液主要由淫羊藿、巴戟天等中藥組成，有溫補(bǔ)腎陽(yáng)的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討羊藿巴戟口服液對(duì)腎陽(yáng)虛不育大鼠模型性激素的改變和精子密度及活動(dòng)率的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性3月齡SD大鼠52只，體質(zhì)量200～220 g，SPF級(jí)，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0001，生產(chǎn)批號(hào)：16053101。購(gòu)買后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠均自由飲水、采食。每天更換籠中的墊料并換水以保持干燥清潔。環(huán)境溫度控制在20～25℃；光照：白天及夜晚各12 h。

1.2 藥物及試劑 羊藿巴戟口服液，主要由淫羊藿、熟地黃、巴戟天、山茱萸、石燕(火煅)、海馬、狗鞭、蛤蚧、蛇床子、大海米、砂仁、鎖陽(yáng)、九香蟲、雄蠶蛾組成，購(gòu)自廣州萬(wàn)正藥業(yè)有限公司，批號(hào)為B20020759。腺嘌呤Ad粉劑，上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：B0010。卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)ELISA檢測(cè)試劑盒，試劑盒由ROCHE免疫試劑公司提供，批文號(hào)分別為：18198300、15778500。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 清華同方精子、微生物動(dòng)(靜)態(tài)圖像分析系統(tǒng)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科實(shí)驗(yàn)室提供。電子秤、恒溫水浴箱、移液槍、灌胃針、-20℃冰箱。

1.4 動(dòng)物分組 將52只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組及空白組。其中模型組、中藥低劑量組及中藥高劑量組各15只，空白組7只。

1.5 建模及藥物干預(yù) 參照文獻(xiàn)[1]建模，腺嘌呤加入2 mL蒸餾水制成混懸液，按每天150 mg/(kg·d)灌胃。模型組及中藥高、低劑量組大鼠連續(xù)灌胃30天，制備大鼠腎陽(yáng)虛不育模型。目前腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的癥狀診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)的是《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》中腎陽(yáng)虛診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)觀察動(dòng)物的外觀表現(xiàn)來(lái)判斷其與腎陽(yáng)虛證的符合程度，確定模型是否成功。一般腎陽(yáng)虛模型會(huì)出現(xiàn)體質(zhì)量下降、體溫下降、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、畏寒、體毛稀疏、失去光澤、采食量、飲水量減少等癥狀。模型成功后，中藥高、低劑量組大鼠分別按6、1.0 g/(kg·d)的劑量灌胃羊藿巴戟口服液30天[2]，模型組和空白組大鼠每天灌胃2 mL生理鹽水，連續(xù)30天后均處死取材。

1.6 體質(zhì)量變化 在腎陽(yáng)虛模型造模成功后，記錄各組大鼠第6、12、18、24、30天體質(zhì)量，并進(jìn)行比較。

1.7 精子活動(dòng)率及精子密度測(cè)定 分別取各組大鼠右側(cè)附睪尾，稱重后將其剪碎、過(guò)濾，稀釋成懸液。在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)精子中活動(dòng)精子數(shù)。通過(guò)清華精子、微生物動(dòng)(靜)態(tài)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)5個(gè)中方格內(nèi)精子數(shù)。從而計(jì)算出精子活動(dòng)率、精子密度(每克附睪尾所含的精子數(shù))。a級(jí)代表一直向前游動(dòng)的精子，b級(jí)代表勉強(qiáng)能向前游動(dòng)精子，c級(jí)代表在原地盤旋的精子，d級(jí)代表精子有明顯殘缺或者死亡。

1.8 血清激素測(cè)定 大鼠處死后從心臟取血，靜置、分層后離心，分離血清，ELISA法檢測(cè)T和FSH含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，多樣本之間的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 灌胃腺嘌呤1周后，模型組及治療組(未灌藥前)大鼠出現(xiàn)飲水量減少、活動(dòng)減少、多尿、泄瀉等腎陽(yáng)虛癥狀，隨著灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)體質(zhì)量下降、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍、豎毛拱背、喜暖畏寒、體毛稀疏、毛發(fā)失去光澤等表現(xiàn)。空白組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食及反應(yīng)等方面未出現(xiàn)異常。2.2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較 見(jiàn)表1。各組大鼠第6天體質(zhì)量變化無(wú)顯著差異(P＜0.05)。自第12天開始，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，中藥高、低劑量組大鼠體質(zhì)量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較(x±s) g

2.3 各組大鼠精子密度比較 見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組大鼠精子密度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，中藥高、低劑量組大鼠精子密度顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥高劑量組大鼠精子密度高于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠精子密度比較(x±s)

2.4 各組大鼠精子活動(dòng)率比較 見(jiàn)表3。與空白組比較，模型組大鼠精子活動(dòng)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，中藥高、低劑量組大鼠精子活動(dòng)率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥高劑量組大鼠精子活動(dòng)率高于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠精子活動(dòng)率比較(x±s) %

2.5 各組大鼠性激素含量比較 見(jiàn)表4。與空白組比較，模型組大鼠FSH、T含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，中藥高、低劑量組大鼠FSH、T含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥高劑量組大鼠FSH、T含量高于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 各組大鼠性激素含量比較(x±s) nmol/L

3 討論

由于生育年齡增大和環(huán)境變化等因素的影響，其中許多少精弱患者出現(xiàn)性激素的改變，同時(shí)伴有不同程度的精子數(shù)量和活動(dòng)率的下降，目前在西藥治療上多給予克羅米芬、十一酸睪酮、維生素E等藥物治療，但部分患者效果不明顯。

性激素的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到生殖軸線上多個(gè)位點(diǎn)的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)精子生成起到關(guān)鍵的作用，其中T、FSH的作用尤為突出。FSH通過(guò)激活cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)性激素的合成；通過(guò)刺激Sertoli細(xì)胞中雄激素受體，提高雄激素受體mRNA和蛋白的水平，而Sertoli細(xì)胞分別將營(yíng)養(yǎng)成分運(yùn)輸給生精細(xì)胞，這對(duì)生精細(xì)胞的生存和代謝有著非常重要的影響[3]。T對(duì)精子的發(fā)生也起著重要的作用，它不僅通過(guò)其受體間接調(diào)節(jié)精子發(fā)生，還通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)參與了下丘腦GnRH信號(hào)調(diào)控[3]。

中醫(yī)藥治療男性不育具有悠久的歷史，大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其可顯著提高精子活力[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主生殖，男性生殖之精蟄藏于腎中，并依賴腎的作用與女性生殖之精搏而成形。若腎陽(yáng)不足，生殖之精缺乏溫煦氣化的作用而致不育，若腎氣盛，則能有子。羊藿巴戟口服液以淫羊藿、巴戟天共為君藥，起補(bǔ)腎陽(yáng)、壯筋骨的作用。同時(shí)予海馬、大海米、狗鞭、蛤蚧、九香蟲、雄蠶蛾等血肉有情之品，補(bǔ)腎壯陽(yáng)，共為臣藥，協(xié)同并增強(qiáng)君藥補(bǔ)腎填精、益精生髓、健固腰腎的功效。方中又加入熟地黃、山茱萸等以滋陰養(yǎng)血，一方面避免過(guò)于溫補(bǔ)而燥血?jiǎng)友?，使溫補(bǔ)而無(wú)化邪之弊；另一方面寓意陰中求陽(yáng)，張景岳《新方八略引》曰：“善補(bǔ)陽(yáng)者，必于陰中求陽(yáng)，陽(yáng)得陰助則生化無(wú)窮”。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，療效確切，共奏溫補(bǔ)腎陽(yáng)的作用。

現(xiàn)代藥理研究表明，羊藿巴戟口服液中的主要成分巴戟天、淫羊藿都有改善生殖的功能。巴戟天中所含的巴戟甲素可提高小鼠的交配能力，提高機(jī)體免疫力[4]；巴戟天根的水提取物和醇提取物可促進(jìn)微波輻射損傷的生殖器官的修復(fù)以及精子的生成[5]；同時(shí)巴戟天寡糖可能是巴戟天促進(jìn)雄性小鼠生精作用的主要物質(zhì)[6]。淫羊藿可增加精子數(shù)量，對(duì)精子膜的過(guò)氧化損傷起到保護(hù)作用，同時(shí)還富含F(xiàn)e、Zn等精子生成的必要微量元素[7～9]。此外，狗鞭之類的鞭類藥物，其含的甾體類成分以雄激素睪酮的含量最高，有促進(jìn)性腺軸的作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)羊藿巴戟口服液應(yīng)用于腎陽(yáng)虛型不育大鼠模型，從中醫(yī)腎主生殖的原理出發(fā)，通過(guò)羊藿巴戟口服液充實(shí)腎中精氣，補(bǔ)腎壯陽(yáng)，鼓動(dòng)腎中陽(yáng)氣，從而補(bǔ)其不足，不僅能改善腎虛的癥狀，同時(shí)，還可以提高大鼠精子密度、活動(dòng)度，增強(qiáng)性激素的調(diào)控，從而增強(qiáng)其生殖能力。

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