高 珊， 張 凱， 朱樹華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

桃果實屬于呼吸躍變型果實，采后果實呼吸躍變致使成熟衰老進(jìn)程加快，出現(xiàn)果實軟化、腐爛、風(fēng)味劣變等現(xiàn)象。采摘后的桃果實可以通過低溫冷藏抑制其代謝活動[1]，使其呼吸得到抑制，達(dá)到果實保鮮的目的，但是桃果實對冷害較為敏感，易出現(xiàn)不能正常后熟、絮敗、果實褐變、風(fēng)味喪失等冷害問題[2]，誘發(fā)果實產(chǎn)生生理紊亂[3-4]。研究結(jié)果表明，桃果實存在中間冷害溫度特性，0 ℃貯藏時能減輕冷害癥狀，使儲藏時間變長[5]。因此，在儲藏過程中保持桃果實正常風(fēng)味是采后桃果實儲存的重點(diǎn)。

大多數(shù)植物組織中都含有磷脂酶D(PLD)，幼苗和種子中含量尤為豐富。它是一種多功能酶，能催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換。它還是一種重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶[6]。早在1947年，Chaikof和Hanahan在胡蘿卜和白菜的提取物中首次分離出具有活性的PLD，之后在棉花籽、蓖麻籽、花生中也分離出PLD[7-8]。此后又有40多種植物的PLD被確認(rèn)[9]。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PLD存在于病毒、原核生物、真核生物中[10]。在生長條件下，植物會受到各種環(huán)境脅迫，在已經(jīng)報道的PLD中，磷脂酶Dα(PLDα)可能在植物應(yīng)對各種脅迫中起關(guān)鍵作用[11]，其在抗冷害脅迫中發(fā)揮著尤為重要的作用[12-13]。其水解產(chǎn)物磷脂酸可以作為第二信使，參與信號的傳導(dǎo)。在各種環(huán)境脅迫如冷害、干旱、高鹽、營養(yǎng)不良、病蟲害等逆境條件下，PLD能產(chǎn)生激活細(xì)胞內(nèi)與抗性有關(guān)的細(xì)胞生理反應(yīng)，從而對環(huán)境脅迫做出應(yīng)答[14-15]。除此之外，在生長、發(fā)育等過程中，PLD都能被激活[16-18]。

目前，關(guān)于PLDα的許多機(jī)理尚不完全清楚，在體外重組PLDα蛋白對于了解桃果實環(huán)境適應(yīng)性與后熟機(jī)理發(fā)揮著非常重要的作用，本試驗借助分子生物學(xué)手段，體外表達(dá)了PLDα蛋白，并對其進(jìn)行了生物學(xué)分析，探究冷信號對PLDα基因表達(dá)的影響，以期為下一步深入研究桃果實的環(huán)境適應(yīng)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桃果實(PrunuspersicaL.Batsch, cv. Feicheng)采摘于山東省泰安市肥城桃園鎮(zhèn)肥城桃基地。從長勢良好的植株上隨機(jī)采摘尺寸接近且無機(jī)械損傷的七成熟桃果實，并立刻運(yùn)回實驗室，4 ℃下預(yù)冷24 h后，分別置于常溫(25 ℃)和低溫(0 ℃)貯藏，常溫儲藏的樣品隔天取樣，低溫儲藏的樣品按周取樣(每周1次)，樣品切塊并立即用液氮處理，之后置于-80 ℃環(huán)境保存。

感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α、表達(dá)載體pET-30a均來源于本實驗室?？寺≥d體pMD18-T Vector購買于TaKaRa公司。表達(dá)菌種Transetta(DE3)購買于北京全式金公司。

試驗所用引物均由華大基因科技公司合成(表1)。

表1試驗所用PCR引物及序列

Table1PCRprimersandsequencesusedintheexperiment

引物名稱 序列(5′→3′)引物用途PLDα?FGGGGTACCATGGCGGAGCCCCAG?GAGCAAT蛋白表達(dá)引物PLDα?RCAAGCTTAGTAGTAAGGATCGGAG?GAAGGTAGPLDα?SGGGACTCAAGGAGGCCAAAGRT?PCRPLDα?ASCAGGATTACGAGGGCATAAGACATUB?SGCACCAACTTGTTGAGAATGCqPCRTUB?ASTTTCAACTGACCAGGGAACC

GGTACC為KpnI酶切位點(diǎn)；AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1PLDα生物信息學(xué)分析 在NCBI (National center for biotechnology information)的GenBank中檢索，得到桃果實PLDα基因堿基序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列，用在線網(wǎng)站工具對PLDα蛋白進(jìn)行二維結(jié)構(gòu)(https://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)和三維結(jié)構(gòu)(http://www.swissmodel.expasy.org/)模擬，使用MEGA 4.1軟件對桃果實PLDα蛋白與其他植物PLDα蛋白氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)以及親水性。

1.2.2 肥城桃果實總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 用改良CTAB法[19]提取桃果實總RNA，超微量紫外可見分光光度計檢驗其純度及完整性。使用寶生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.3PLDα蛋白的體外表達(dá) 根據(jù)PLDα氨基酸序列全長，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)(KpnI和Hind III)的引物PLDα-F、PLDα-R(表1)。以cDNA為模板經(jīng)過PCR獲得PLDα基因的全長，PCR產(chǎn)物回收目的基因后與pMD18-T Vertor構(gòu)建克隆載體?？寺≥d體與pET30a分別用KpnI和Hind III雙酶切并回收后，用T4 DNA Ligase(TaKaRa)連接回收片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-PLDα，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌株Transetta(DE3)中，雙酶切驗證和菌液PCR驗證后誘導(dǎo)蛋白質(zhì)體外表達(dá)，取100 μl上述菌液加入到50 ml液體培養(yǎng)基(含50 μg/L Kana)中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為 0.4～0.6，取1 ml菌液用于聚丙烯酰胺電泳檢測，向剩余菌液中加入50 μl 1 mol/L IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)，37 ℃條件下?lián)u菌分別誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h，取1 ml該菌液用于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.4PLDα基因表達(dá)量檢測 桃果實PLDα基因表達(dá)量的分析采用試劑盒(TaKaRa SYBR? PremixExTaq)說明書的方法，設(shè)計PLDα基因的熒光定量PCR引物以及內(nèi)參引物PLDα-S、PLDα-AS、TUB-S、TUB-AS(表1)，以cDNA 為模板，用BioRad CFX connect 實時熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測。每個樣品平行測定3次，以試驗基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)之比作為衡量試驗基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLDα生物信息學(xué)分析

從PLDα蛋白氨基酸序列(圖1)發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在2個HKD基序，分別為HQKIVVVD和HTKMMIVD，兩基序間隔320個氨基酸，這與標(biāo)志序列相符合。借助ProtParam tool預(yù)測PLDα蛋白分子式為C4 135H6 363N1 139O1 202S26，原子總數(shù)12 865，分子量92 097.48，理論等電點(diǎn)5.90，理論半衰期30 h。不穩(wěn)定系數(shù)為41.22，表明該蛋白不穩(wěn)定。親水性平均系數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.417，預(yù)測該蛋白為疏水性蛋白。對PLDα蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，從圖2中發(fā)現(xiàn)，肥城桃果實PLDα蛋白由12段α螺旋、26段β折疊和無規(guī)則卷曲交替構(gòu)成。圖3顯示了PLDα蛋白不同角度的三維立體結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)其蛋白中心有一“洞穴”結(jié)構(gòu)，這和蛋白的疏水性是相一致的。

圖1 肥城桃果實PLDα氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of PLDα in Feicheng peach fruits

2.2 PLDα蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)顯示，同屬薔薇科的桃和草莓(Fragariaxananassa)在進(jìn)化關(guān)系上位于同一簇分支，聚為一類，說明二者親緣關(guān)系最近，且該基因在親緣關(guān)系較近的物種間具有非常高的一致性。

2.3 PLDα蛋白體外表達(dá)

提取的總RNA，電泳結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?8 S與18 S條帶明亮，且28 S 與18 S 光密度之比為2.05，接近2∶1。使用微量紫外分光光度計對總RNA溶液進(jìn)行濃度分析，OD280/OD260為2.01，OD260/OD230為2.00，表明所得RNA純度較高，蛋白質(zhì)及有機(jī)物含量較低，可以利用提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

重組質(zhì)粒pET30a-PLDα體外表達(dá)電泳結(jié)果如圖6A所示，分子量約為101 000。從圖6B來看誘導(dǎo)時間為4 h、6 h時，重組蛋白表達(dá)量均較高。

2.4 不同儲藏條件下PLDα基因表達(dá)量的變化

圖2 PLDα蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Secondary structure prediction of PLDα protein

由圖7可知，在常溫儲藏條件下，PLDα基因表達(dá)量在第6 d出現(xiàn)一個小高峰，之后大幅降低，在第8 d降到最低值，此時基因表達(dá)量為0 d的9.8%，在整個常溫儲藏過程中PLDα基因表達(dá)量是低于0 d的。在冷藏條件下，PLDα基因表達(dá)量大幅降低，1周時降到最低值，此時基因表達(dá)量為0 d的56%，之后逐漸升高，在3周達(dá)到峰值，此時基因表達(dá)量為0 d的1.4倍。在整個儲藏過程中，低溫條件下PLDα基因的表達(dá)水平明顯高于常溫儲藏，可見，PLDα基因的表達(dá)受低溫的調(diào)控，可能參與桃果實對低溫脅迫的響應(yīng)。低溫儲藏過程中，PLDα基因表達(dá)量出現(xiàn)躍升過程(第3周)，常溫儲藏過程中，PLDα基因表達(dá)量同樣出現(xiàn)躍升過程(第6 d)，這與桃果實呼吸躍變規(guī)律相一致，可見，PLDα基因的表達(dá)可能與果實采后呼吸躍變有關(guān)。

圖3 PLDα蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Tertiary structure prediction of PLDα protein

分支上的數(shù)值表示1 000次重復(fù)計算得到的Bootstrap值。圖4 肥城桃果實PLDα與其他物種PLDα系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PLDα in Feicheng peach and PLDα proteins in other plants

圖5 桃果實總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 1% agarose gel electrophoresis of total RNA in peach fruits

A： PLDα重組蛋白表達(dá);B：PLDα重組蛋白誘導(dǎo)時間優(yōu)化。M：低分子蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：含pET30a質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)粗提物；2：含pET30a質(zhì)粒，未誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)粗提物；3：含pET30a-PLDα質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)粗提物；4：含pET30a-PLDα質(zhì)粒，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)粗提物；1′：pET30a-PLDα質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2 h的蛋白質(zhì)粗提物；2′、4′、6′：pET30a-PLDα質(zhì)粒未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)粗提物；3′：pET30a-PLDα質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h蛋白質(zhì)粗提物；5′：pET30a-PLDα質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6 h蛋白質(zhì)粗提物。圖6 PLDα 重組蛋白 12% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳Fig.6 Analysis of recombinant PLDα protein by 12% SDS-PAGE

圖7 常溫(a)和低溫(b)貯藏條件下桃果實PLDα基因表達(dá)水平Fig.7 PLDα expression level under normal(a) and low(b) temperature storage condition

3 討 論

本試驗通過GenBank檢索得到PLDα的全長序列，在此基礎(chǔ)上體外重組了pET30a-PLDα克隆載體，并在Transetta(DE3)中成功表達(dá)獲得PLDα重組蛋白。對PLDα蛋白二級結(jié)構(gòu)模擬可以看出該蛋白由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中β折疊結(jié)構(gòu)所占比例較大。三維結(jié)構(gòu)模擬的“洞穴”結(jié)構(gòu)可以很好地解釋該蛋白的疏水性。而蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹則表明桃果實PLDα蛋白與草莓PLDα蛋白二者親緣關(guān)系最近，且該基因在親緣關(guān)系較近的物種間具有非常高的一致性。從桃果實基因表達(dá)量的變化可以看出，低溫儲藏使PLDα基因的表達(dá)水平明顯提高。

PLDα的標(biāo)志序列為HKD基序，PLDα氨基酸序列中含有2個H×K××××D基序，其中H為His(組氨酸)、K為Lys(賴氨酸)、D為Asp(天冬氨酸)，HKD1和HKD2之間相距約320個氨基酸，同時HKD基序也是催化水解的活性部位[20]。而其催化水解產(chǎn)物磷脂酸(PA)能夠參與植物對環(huán)境脅迫的應(yīng)答。對PLDα氨基酸序列分析結(jié)果表明，本試驗體外表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列同樣存在2個HKD基序(HQKIVVVD和HTKMMIVD)，兩基序中間包含320個氨基酸，這與標(biāo)志序列相符合。由此可以證明，PLDα在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫中起著重要的作用?？岛琨惖萚21]對蒙古冰草的研究結(jié)果表明，PLDα分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的可能性分別為56.5%和21.7%，而分布在液泡中的可能性僅為4.3%，PLD酶類含有具有催化活性的N端和負(fù)責(zé)感受信號刺激的C端。

有研究結(jié)果表明，PLD幾乎在植物所有的生命階段及對環(huán)境脅迫的應(yīng)答中起著重要的作用[22]。不同PLD的功能可以是獨(dú)特的也可以是重疊的，這取決于具體的環(huán)境脅迫，根據(jù)不同的環(huán)境脅迫，不同的PLD會表現(xiàn)出各自的功能。PLDα與植物應(yīng)對低溫脅迫密切相關(guān)[23]，同時也能促進(jìn)氣孔閉合并減少水分流失。本試驗實時熒光定量PCR結(jié)果表明，低溫能提高PLDα基因mRNA基因表達(dá)水平，Mao等[24]對冷脅迫下黃瓜果實PLD基因研究結(jié)果表明PLD在黃瓜響應(yīng)冷脅迫過程中起重要作用，由此推測PLDα可能以信號分子的身份參與果實對冷脅迫的感應(yīng)與識別。PLDα基因表達(dá)水平與桃果實呼吸躍變的特性兩者變化是一致的，由此推測桃果實PLDα基因表達(dá)特征與桃呼吸躍變的特性可能有關(guān)。關(guān)于PLDα響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)理研究尚在進(jìn)行中，本試驗研究結(jié)果為深入研究桃果實的耐冷性和低溫貯藏奠定了理論基礎(chǔ)。

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