陳光哲， 鄭紅霞, 祝長青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實驗室，江蘇 南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210095； 3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001)

鱘類是現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一，是一億五千萬年前中生代留下的稀有古代魚類，其被譽為研究魚類和脊椎動物進化的“活化石”。在中國境內(nèi)，分布著一些野生鱘魚，其中中華鱘是中國特有的珍貴鱘類，具有重要的科學(xué)價值和難以估量的生態(tài)、社會、經(jīng)濟價值，有“水中大熊貓”之稱[1-5]。但是，近年來，由于水域污染、人為捕撈、水利工程的建設(shè)以及資源的過度開采等原因?qū)е铝酥腥A鱘的數(shù)量急劇減少。中國已經(jīng)將中華鱘列入《國家重點保護水生野生動物名錄》，并按照一級保護野生動物實施保護。2010年，國際自然保護聯(lián)盟紅色名錄也收錄其為極危物種[6-9]。因此，保護中華鱘迫在眉睫，而建立快速、靈敏、特異的中華鱘及其產(chǎn)品的檢測鑒定方法是保護和拯救這一珍稀瀕?！盎罨钡挠行Ъ夹g(shù)措施之一。

近幾年來，一些水生生物的物種鑒定方法陸續(xù)在國內(nèi)外研究中被報道，主要包括形態(tài)學(xué)鑒定[10]、同工酶電泳分析[11]、染色體組型分析[12]、COI基因分析[13]等。這些方法雖已被運用于多種水生生物的鑒定，但是在實際應(yīng)用中仍然具有一定的局限性。形態(tài)學(xué)、同工酶鑒定等方法由于受到檢測對象需為活體條件的限制，無法應(yīng)用在水產(chǎn)加工產(chǎn)品上；染色體組型分析、COI基因分析等方法也存在操作繁瑣、耗時過長等不足[10-13]。PCR(聚合酶鏈式反應(yīng),Polymerase chain reaction)技術(shù)以其靈敏度高、特異性強等優(yōu)點脫穎而出，在近幾十年被全世界許多科研機構(gòu)和實驗室所采用。尤其是實時熒光PCR 技術(shù)，實現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，既可省去普通PCR 檢測過程中PCR 產(chǎn)物后續(xù)的分析與驗證步驟(如凝膠電泳和探針雜交)，簡化檢測過程，又能夠減少試驗操作過程中的EB (溴化乙錠Ethidium bromide)污染，使試驗更具安全性，同時邊擴增邊檢測，還可以提高檢測速度[14-16]。因此，與常規(guī)PCR 相比，實時熒光PCR 技術(shù)具有準確性高、特異性強、自動化程度高、可有效解決PCR 污染等優(yōu)勢[17-18]，已成為一種成熟的主流基因檢測平臺，并且應(yīng)用在諸多領(lǐng)域，如食品安全檢驗、食品成分來源檢驗[19]等。

本試驗根據(jù)NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心，National center for biotechnology information)上已經(jīng)公布的中華鱘D-loop基因的核酸序列，設(shè)計并篩選出特異性的引物和探針，建立中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法，為中華鱘的物種鑒定及種質(zhì)資源保護提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 中華鱘供試樣品為漁業(yè)保護部門提供；西伯利亞鱘、達氏鱘、史氏鱘購自鱘魚養(yǎng)殖場，其他用于對照試驗的動物種類購自于南京農(nóng)貿(mào)市場(表1)。

表1供試樣品的種類

Table1Speciesofsamples

序號樣品名稱序號樣品名稱序號樣品名稱序號樣品名稱1中華鱘13螃蟹25雞肉37蚌仔2史氏鱘14黃鱔26叉尾鮰魚38毛蚶3西伯利亞鱘15帶魚27梭魚39文蛤4河豚16黃顙魚28牛蛙40斑節(jié)蝦5蚌17鱸魚29螯花魚41小青龍蝦6牙鲆18魷魚30鯧魚42單環(huán)刺縊7斑馬魚19豬肉31黑魚43梅蛤8鱉20牛肉32黃魚44大閘蟹9鯉魚21羊肉33鳊魚45蝦蛄10河蝦22鴨肉34青魚46青蟹11對蝦23江白蝦35海蟹47梭子蟹12鯽魚24花蟹36香螺48克氏原螯蝦

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 pMD19-T克隆載體和感受態(tài)細胞DH5α，南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 Tiangen海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit，目錄號：DP324)， Tiangen瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANamp Agarose Gel DNA Purification Kit，目錄號：DP209)， AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，目錄號：AP-MN-P-50)，普通PCR預(yù)混液SapphireAmp Fast PCR Master Mix(寶生物有限公司產(chǎn)品)，實時熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液CS qPCR Master Mix(上海輝睿生物科技公司產(chǎn)品)，中華鱘基因引物及探針(上海輝睿生物科技公司產(chǎn)品)。

1.1.4 儀器 NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific公司產(chǎn)品)，AQE -183-2全自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司產(chǎn)品)，LightCycler 480 II實時熒光PCR擴增儀(Roche公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 使用Tiangen海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取中華鱘及對照生物的DNA。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI上公布的中華鱘D-loop基因序列設(shè)計引物探針組合，上游引物F：5′- CAAGAACACAAGATTAATGAG -3′,下游引物R：5′- GATCAAGGTATGTCGATGACA -3′，熒光探針P：5′- 熒光基團-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-淬滅基團-3′，熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 以中華鱘DNA為模板，利用引物對其進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，將目的DNA片段經(jīng)TA克隆連接至pMD19-T載體中，得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α內(nèi)增殖，篩選陽性克隆，進行菌液PCR檢測，取約100 μl陽性克隆菌液送南京鐘鼎生物技術(shù)公司測序，以確定克隆片段序列的準確性。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，根據(jù)下列公式計算拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=(質(zhì)粒質(zhì)量×6.02×1023)/(質(zhì)粒分子堿基對數(shù)×324.50×2.00)。

1.2.4 TaqMan實時熒光PCR TaqMan實時熒光PCR反應(yīng)體系為10 μmol/L上游引物1.0 μl，10 μmol/L下游引物1.0 μl，10 μmol/L探針0.6 μl，50 ng/μl DNA模板2.2 μl,2倍熒光PCR緩沖液12.5 μl，去離子水9.0 μl。反應(yīng)體系終濃度為1倍熒光PCR緩沖液，上游引物0.40 μmol/L，下游引物0.40 μmol/L，探針0.24 μmol/L。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 40 s，45個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火延伸時收集熒光信號；40 ℃冷卻 30 s。反應(yīng)結(jié)束后，運用配套軟件進行分析。

1.2.5 特異性評定 以中華鱘及對照生物的DNA為模板，并設(shè)置空白對照，進行TaqMan實時熒光PCR反應(yīng)。

1.2.6 靈敏度測定

1.2.6.1 核酸濃度 以濃度為1.0×10-5ng/μl、 1.0×10-4ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-1ng/μl 的中華鱘DNA為模板，設(shè)置空白對照，進行TaqMan實時熒光PCR擴增。

1.2.6.2 重組質(zhì)粒 以每1 μl拷貝數(shù)達到1個拷貝、101個拷貝、102個拷貝、103個拷貝、104個拷貝的重組質(zhì)粒DNA為模板，并設(shè)置空白對照，應(yīng)用建立的TaqMan實時熒光PCR檢測方法進行擴增。

1.2.7 TaqMan實時熒光PCR檢測方法的驗證 將本研究建立的實時熒光PCR檢測方法應(yīng)用于全國多個省市采集的63個鱘魚樣品，以驗證該方法的特異性和靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對重組質(zhì)粒進行克隆與測序，克隆片段序列與NCBI上中華鱘的D-loop基因序列比對，結(jié)果顯示能夠準確擴增出長度為489 bp的中華鱘D-loop基因，并且擴增片段成功與質(zhì)粒載體連接形成長度為3 181 bp的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)?？寺∑螠y序結(jié)果如下：GATCAAGGTATGTCGATGACAAGTCAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAGAAATATAGGGCCTGTCCGACATAAGGGGGTAGGGGGTTTGTCGACAATAAACGCCCGCACCTCGAAGTTCATGTGGGGAGGCAAAATCAGGTCTTGTAAAACACTCTCATGTGTGGATGTTAGATATATGTCCTTGCATCATTCATTATTCATTCCTCCGAGCAGTTGTGTAATGTTCTACCTTGTTGTTCTTTTCTGAAGGAGTTCTACATGTCAGTGAATGGAAACCCAGATTAAAAGTGCCAAATGTTGACAAGATTCTTGGCATGTGGGGTCATGGATTTTACAGTATTTTTAACATCAATCATATGCCAGACATAGTTCAGTTATGGGGAGTTTAACTATTAATGGGCCTGAGATAGAAGCCAAATGCCAGTAATAGTTCAATTTTAGGTCTTTTACAGGTACTGTCCTTCATCTCATTAATCTTGTGTTCTTG提取的重組質(zhì)粒DNA利用NanoDrop 1000 微量紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度，DNA的A260/A280平均值為1.77，DNA的平均濃度為2 789.3 ng/μl。重組質(zhì)粒DNA的濃度稀釋至28.0 ng/μl，根據(jù)公式計算拷貝數(shù)，相當于1 μl溶液中含有 8.16×109拷貝重組質(zhì)粒DNA，用超純水將重組質(zhì)粒溶液稀釋成1 μl 108個拷貝， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 特異性

F-R-P引物/探針組合對試驗所檢測各物種的特異性試驗結(jié)果顯示，當使用引物和探針組合F-R-P對48種DNA樣本進行擴增時，只有在中華鱘的DNA樣本出現(xiàn)擴增曲線，而在其他物種中沒有出現(xiàn)擴增曲線。因此建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法具有高度的特異性。

2.3 靈敏度

2.3.1 核酸濃度 應(yīng)用建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法對倍比稀釋的中華鱘DNA進行擴增，結(jié)果見表2。試驗結(jié)果顯示中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法靈敏度可達到1.0×10-3ng中華鱘DNA。

表2中華鱘TaqMan實時熒光PCR體系的靈敏度(核酸濃度)的Ct值

Table2TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(theconcentrationofnucleicacids)

NDA質(zhì)量(ng)Ct值0．1000029．360．0100032．750．0010034．770．00010-0．00001-空白對照-

2.3.2 重組質(zhì)粒 應(yīng)用建立的F-R-P檢測體系對重組質(zhì)粒DNA進行靈敏度的檢測，擴增檢測結(jié)果見表3。試驗結(jié)果顯示中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法靈敏度可達到100拷貝的重組質(zhì)粒DNA。

2.4 檢測方法的驗證

將本研究建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法應(yīng)用于全國多個地區(qū)采集的63個鱘魚樣品中，檢測結(jié)果顯示：許多餐館中號稱的“中華鱘”其檢測結(jié)果不是真正的中華鱘，而只是其他的一些鱘魚品種。其中7個從相關(guān)科研單位得到已經(jīng)鑒定的中華鱘標本，經(jīng)檢測才是真正的中華鱘，檢測曲線圖譜如圖1所示。

表3中華鱘TaqMan實時熒光PCR體系的靈敏度(重組質(zhì)粒)的Ct值

Table3TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(recombinantplasmid)

重組質(zhì)?？截悢?shù)Ct值1000030．68100033．9910038．9510-1-空白對照-

圖1 部分鱘魚樣品的檢測曲線Fig.1 The amplification curves of some sturgeon samples

3 討 論

目前建立的中華鱘物種鑒定方法主要包括形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶電泳分析、染色體組型分析、COI基因分析等方法，然而上述方法均存在某些局限性，不能對中華鱘及其產(chǎn)品進行快速而準確的檢測。因此為給中華鱘提供及時而有效的保護，建立中華鱘及其產(chǎn)品的快速檢測方法是十分必要的。

實時熒光PCR技術(shù)在近年來發(fā)展迅速，已成為目前應(yīng)用較為廣泛的一種檢測方法。實時熒光PCR技術(shù)中常用的熒光材料有SYBR Green染料、TaqMan探針、分子信標、熒光共振能量傳遞(FRET)探針、復(fù)合探針等[20]。其中，TaqMan探針是一種水解寡核苷酸探針，其序列與目標序列上下游引物之間的一段DNA模板完全互補，5′端標記報告熒光基團(Reporter)，3′端標記淬滅熒光基團(Quencher)，每擴增1條DNA鏈，就會有1個TaqMan探針被水解下來，并隨之釋放出一個熒光信號，熒光信號的積累與PCR產(chǎn)物的增加是同步進行的[20]。TaqMan實時熒光PCR檢測技術(shù)能夠避免非特異性產(chǎn)物與探針的雜交，從而保證了檢測特異性[21]。目前該技術(shù)已經(jīng)在多種動植物物種及其產(chǎn)品的鑒定方面得到了成功的應(yīng)用[22]。

D-loop區(qū)是線粒體基因組上DNA序列和長度變異最大的一段非編碼區(qū)，各個物種的D-loop基因具有較好的特異性[23]。本研究根據(jù)NCBI上公布的中華鱘D-loop基因序列，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件設(shè)計并篩選出相應(yīng)的引物和探針組合，經(jīng)過TaqMan實時熒光PCR擴增和克隆測序，設(shè)計的引物和探針組合能夠特異、高效地擴增靶序列，擴增產(chǎn)物(長度為489 bp)測序結(jié)果與 NCBI上中華鱘D-loop基因序列一致。

本研究所建立的中華鱘TaqMan實時熒光PCR檢測方法，應(yīng)用于大量實際樣品后的試驗結(jié)果均符合預(yù)期，充分證實了該方法可以應(yīng)用于中華鱘的物種鑒定，該檢測方法特異性好、靈敏度高、可操作性強，具有較好的應(yīng)用和推廣價值，可以為中國中華鱘的鑒別以及物種資源保護工作提供可靠的技術(shù)支撐。

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