張 蕾， 張響英， 章敬旗， 張 揚， 常國斌， 陳國宏， 董 飚， 吳炳鑫， 王 健

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300; 2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

高郵鴨是江蘇省的優(yōu)良地方畜禽品種，尤以善產雙黃蛋而享譽海內外。雙黃蛋的產生，主要是由于禽類的2個卵泡同時成熟并排卵，而后2個卵子一同進入輸卵管，在輸卵管內依次被蛋白質、殼膜以及蛋殼等物質包裹后最終形成[1]。這一過程的觸發(fā)與家禽的卵泡發(fā)育過程密不可分[2]。迄今為止，對高郵鴨雙黃蛋性狀的調控機制未見詳細報道。

家禽的卵泡發(fā)育是由多因素調控的復雜過程，在此過程中下丘腦-垂體-卵巢這一生殖軸起到關鍵的調節(jié)作用。肝臟是家禽脂肪酸氧化分解的主要場所，同時也是合成脂蛋白、卵黃前體物質的主要場所，對家禽的產蛋量及蛋品質有重要的影響。已有研究結果表明，FSHR(卵泡刺激素受體)參與家禽卵巢的發(fā)育調節(jié)過程，并可能參與調控家禽等級卵泡的啟動[3]。ERβ(雌激素受體β)由卵巢合成和分泌，對卵巢早期發(fā)育以及卵泡的生長發(fā)育等過程起著重要作用[4]。GnRHR(生長激素受體)調控FSH的合成與釋放，從而調控卵巢的繁殖性能，有研究結果表明GnRHR與母雞雙黃蛋產蛋性能密切相關[5]。

本研究結合前期高郵鴨個體產蛋記錄，篩選出雙黃蛋高、低產高郵鴨個體，對比兩組個體血液中激素水平，下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢組織中繁殖性能相關基因的表達，并結合卵巢組織HE染色和FSHR免疫組化染色，從組織學和分子生化水平探究雙黃蛋高、低產高郵鴨繁殖機能的差異性，為進一步研究高郵鴨雙黃蛋發(fā)生的調控機制以及高郵鴨相關育種工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

試驗動物為江蘇省泰州市豐達水禽育種公司同一棟鴨舍內單只籠養(yǎng)的330日齡高郵鴨。根據個體產蛋記錄篩選出雙黃蛋高、低產組高郵鴨個體各6只。

主要試劑：MicroElute Genomic DNA 試劑盒、Trizol regent、mirVanaTM RNA分離試劑盒(Applied Biosystem p/n AM1556)、QIAGEN RNeasy?試劑盒、反轉錄試劑盒、LowInput Quick-Amp Labeling試劑盒、anti-FSHR(Biorbyt公司產品)、兔抗FSHR多克隆抗體(Zymed公司產品)、蘇木精、伊紅等(海南合輝公司產品)。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄 采用硫氰酸胍-酚-氯仿法提取各組織總RNA，經紫外分光光度儀測定總RNA 濃度和純度后，使用TaKaRa反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血液生化指標檢測 空腹翼靜脈采血5 ml，靜置30 min，以3 000 r/min迅速離心15 min，吸取上層血清，-20 ℃保存。全自動血液生化分析儀(Olympus Au 600)檢測血清生化指標。

1.2.3 卵巢組織切片 試驗鴨屠宰后，取卵巢組織流水沖洗，于4%多聚甲醛中固定24 h。梯度酒精脫水后進行石蠟包埋，5～8 μm厚度連續(xù)切片。參考姜曉龍等[6]的方法進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，參考吳馨培等[7]的方法進行FSHR免疫組化染色。用Olympus光學顯微鏡觀察高郵鴨卵巢卵泡發(fā)育情況。

1.2.4 Image pro-plus 4.5圖像分析 每只高郵鴨選取3張HE染色和FSHR免疫組化染色切片，根據卵泡發(fā)育水平，選取視野中發(fā)育階段相似的卵泡，并進行卵泡等級分類，同時計數各級卵泡免疫組化陽性細胞數量[8]。

1.2.5 Quantitative Real Time PCR(qRT-PCR) 檢測 試驗鴨屠宰后，取下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢組織，用RNeasy kit試劑盒提取細胞總RNA，并反轉錄成cDNA，以此為模板進行qRT-PCR。根據GenBank中收錄的鴨相關基因mRNA序列，用Primer 5.0軟件設計引物[9](表1)，以β-actin基因為內參，使用SYBR熒光定量PCR試劑盒和ABI7500 System熒光定量儀器，檢測相關基因的表達情況。

表1qRT-PCR引物信息

Table1PrimesinformationforqRT-PCR

基因 引物序列(5′→3′)退火溫度(℃)產物大小(bp)FSHRF：GCAAGCCCAGATTTACAGAACAGACA60128R：CAAGTGATTTAGAGGAACCAGTGAERF：CAAGTGATTTAGAGGAACCAGTGA61126R：GCAGAAGAACCTGAAAGCAACAGnRHRF：TCTGCTGGACCCCCTACTAC55107R：GCCAAAGATGAAGAGGATGTGβ?actinF：ATGCAGAAGGAGATCACAGC58167R：GAGGGTCCGGATTCATCATA

1.2.6 數據分析 所有數據以平均數±標準差表示。應用GraphPad Prism5統(tǒng)計學軟件，進行兩樣本均數間t檢驗。

2 結 果

2.1 高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢形態(tài)結構差異

對高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢組織切片進行HE染色，同等倍鏡下觀察對比卵泡發(fā)育情況。結果(圖1)表明：高產雙黃蛋高郵鴨卵巢上卵泡發(fā)育良好，卵巢上密布著小黃卵泡(6～8 mm)和大白卵泡(3～5 mm)，而低產雙黃蛋高郵鴨卵巢上小白卵泡(<2 mm)較多。高倍鏡下對各組卵泡結構進行對比發(fā)現，低產雙黃蛋高郵鴨卵泡膜層和顆粒層較薄，內外膜層分界不明顯；高產雙黃蛋高郵鴨卵泡膜層較厚，內外膜分界明顯。由此可見，高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢在組織結構上存在明顯差異。

A、C分別為低產組高郵鴨卵巢×50、×100倍鏡下圖片，B、D分別為高產組高郵鴨卵巢×50、×100倍鏡下圖片。圖1 高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢HE染色切片Fig.1 The HE staining slices of high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck

2.2 高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢FSHR免疫組化分析

對高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢組織切片進行FSHR免疫組化染色，FSHR陽性細胞中顯現黃色或棕黃色反應顆粒，卵巢中FSHR免疫組化陽性反應顆粒多分布于顆粒細胞、膜細胞以及卵母細胞中(圖2)。低產組卵巢中FSHR陽性細胞染色較淺、呈淺黃色，顆粒細胞松散呈單層結構；高產組卵巢中FSHR陽性細胞染色較深、呈棕黃色，顆粒細胞呈多層且排列緊密?？梢?，高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢在結構及蛋白質表達上存在較大差異。

A為低產組；B為高產組。圖2 高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢FSHR免疫組化染色切片(×100)Fig.2 The FSHR staining slices of high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck (×100)

2.3 高、低產雙黃蛋高郵鴨血液激素水平差異

檢測高、低產雙黃蛋高郵鴨血清中卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、孕酮(P)、雌二醇(E2)以及睪酮(TEST)激素水平。結果(圖3)表明：高產組FSH、E2和 P含量均極顯著高于低產蛋組(P<0.01)，而LH和TEST含量在兩組之間均無顯著差異。

a:卵泡刺激素(FSH)；b：黃體生成素(LH)；c：孕酮(P)；d：雌二醇(E2)；e：睪酮(TEST)。D為低產組，G為高產組。圖3 高、低產雙黃蛋高郵鴨血清激素水平Fig.3 Hormonal level in high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck serum

2.4 高、低產雙黃蛋高郵鴨繁殖性狀相關基因表達差異

采用qRT-PCR方法檢測與繁殖性狀相關的關鍵基因FSHR、ERβ和GnRHR在高郵鴨下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢中的表達。結果(圖4)表明：高產組高郵鴨下丘腦中FSHR表達量極顯著高于低產組(P<0.01)，而ERβ表達量極顯著低于低產組(P<0.01)，GnRHR在兩組中的表達差異不顯著；高產組高郵鴨垂體及肝臟中FSHR、ERβ和GnRHR的表達量均極顯著高于低產組(P<0.01)；卵巢中FSHR、ERβ和GnRHR的表達量在兩組中差異不顯著。

圖4 高、低產雙黃蛋高郵鴨繁殖相關基因的表達量Fig.4 Expression of reproduction-related genes of high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck

3 討 論

李佳宜等[8]通過觀察東鄉(xiāng)綠殼蛋雞高、低產個體卵巢結構，發(fā)現高產組卵巢卵泡較低產組豐富，卵泡光滑而無塌陷。王巖等[10]對比高、低產烏雞卵巢，發(fā)現高產組卵泡較多，而低產組初級卵泡數量占多數。本試驗通過HE染色及FSHR免疫組化染色對高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢進行對比觀察，發(fā)現高產組卵泡發(fā)育良好，顆粒細胞豐富且排列緊密；低產組卵泡發(fā)育遲緩，大量閉鎖，顆粒細胞疏松呈單層結構。

生殖軸激素是調控家禽卵巢發(fā)育及其產蛋性能的主要內分泌因子。Zhang等[11]研究結果表明FSH是調控卵泡發(fā)育的主要激素；楊淑華等[12]研究發(fā)現，E2主要由大中型卵泡分泌，P對卵巢排卵功能具有正負反饋調節(jié)作用。本試驗發(fā)現，在所檢測的5種激素中，FSH、E2和P在高產雙黃蛋高郵鴨血清中的含量均顯著高于低產雙黃蛋高郵鴨，而LH和TEST無顯著差異。FSH、E2和P 3種激素之間相互協(xié)同，對高郵鴨卵巢的功能以及卵泡的發(fā)育起到綜合調控作用。

禽類的卵巢卵泡發(fā)育以及產蛋過程還受到多個基因的調節(jié)作用。本試驗篩選出與繁殖性狀相關的生殖激素受體基因FSHR、ERβ和GnRHR，并檢測它們在高郵鴨下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢中的表達。結果顯示這3個基因在高、低產雙黃蛋高郵鴨垂體和肝臟中的mRNA表達存在極顯著差異(P<0.01)，而在卵巢中的表達量差異不顯著，FSHR和ERβ在下丘腦中也存在極顯著差異(P<0.01)。這與陳杰[9]研究結果相一致，FSHR對卵巢早期發(fā)育起重要調節(jié)作用，隨著卵泡的發(fā)育成熟，卵巢對FSH反應的靈敏性向LH遷移，FSHR對卵泡發(fā)育的調節(jié)功能減弱。說明高郵鴨雙黃蛋產蛋機能與下丘腦、垂體和肝臟的調控作用密不可分。

禽類產蛋過程是一個復雜的發(fā)育生物學過程，受到生殖軸和生長軸激素的調節(jié)以及相關基因的調控。本試驗依據前期高郵鴨的產蛋記錄，篩選出高郵鴨雙黃蛋高產組和低產組，對高郵鴨雙黃蛋的產蛋性能進行了探討，高、低產雙黃蛋高郵鴨卵巢結構、激素水平和相關基因表達特征的對比分析結果表明高郵鴨雙黃蛋的產蛋機能與下丘腦、垂體和肝臟調控功能密不可分，這為進一步研究高郵鴨雙黃蛋的產蛋機制提供了一定的理論基礎，但確切的調控機制仍需要后續(xù)更深入的研究。

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