李 慢，周新剛，張 亮，王 鵬

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院病理科，北京 100015

Wilson病(Wilson’s disease, WD)，又稱肝豆?fàn)詈俗冃跃C合征(hepatolenticular degeneration, HLD)，是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙引起的疾病[1]，全世界范圍的WD患病率為1/30 000～1/100 000。WD基因位于人13號(hào)染色體[2]，表達(dá)產(chǎn)物為能夠參與銅跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的P型三磷酸腺苷酶(ATP7B)[3]。WD患者因?yàn)锳TP7B基因發(fā)生突變，導(dǎo)致銅跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能異常，銅在機(jī)體內(nèi)沉積，銅離子的過多蓄積會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生肌肉震顫、角膜色素環(huán)、肝硬化和神經(jīng)退行性病變等[4]。ATP7B基因共包含21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)80 kb，目前已經(jīng)報(bào)道存在500多種突變位點(diǎn)[5]。

WD患者ATP7B基因所有的外顯子都可以發(fā)生突變，由于種族地域和臨床表現(xiàn)的差異，ATP7B基因突變位點(diǎn)不同。通過對(duì)ATP7B基因外顯子測(cè)序研究，有助于我們進(jìn)一步完善對(duì)WD的認(rèn)識(shí)。本研究通過對(duì)以肝病為首發(fā)表現(xiàn)的中國WD患者ATP7B基因外顯子進(jìn)行測(cè)序，總結(jié)我國WD患者ATP7B基因外顯子突變的特點(diǎn)，探討基因突變位點(diǎn)和肝臟病理的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2012年4月至2016年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院肝病科診治的WD患者，經(jīng)患者同意后進(jìn)行基因檢測(cè)。共收集45例患者，男29例，女16例，年齡(26.8±10.6)歲(0.2～55歲)，另選20名無親緣關(guān)系健康者為對(duì)照組，男12名，女8名，年齡(27.7±2.7)歲(24～33歲)。兩組性別、年齡相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2WD診斷標(biāo)準(zhǔn)目前臨床上WD的診斷依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：(1)家族遺傳史：父母是近親婚配，同胞有WD患者或死于原因不明的肝?。?2)緩慢進(jìn)行性震顫、肌僵直、構(gòu)音障礙等錐體外系癥狀、體征或/和肝癥狀；(3)肉眼或裂隙燈證實(shí)有K-F角膜色素環(huán)；(4)血清銅藍(lán)蛋白(CP)<200 μg/ml，或血清銅氧化酶<0.2活力單位；(5)24 h尿銅排泄量>1 000 μg(1.56 μmol)；(6)肝銅>250 μg/g(干質(zhì)量)。凡完全具備上述1～3項(xiàng)或1和4項(xiàng)者，可確診為臨床表現(xiàn)型；具備上述3～5項(xiàng)者或3～4項(xiàng)者為癥狀前型；僅有1～2項(xiàng)或1、3項(xiàng)者，懷疑為WD，通過第6項(xiàng)確診。

1.3超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺及組織學(xué)檢查采用日本Aloa-4000型超聲儀，5.0 MHz專用穿刺探頭，固定18 G×20 cm穿刺針入自動(dòng)活檢槍，無菌操作，體表定位后，用質(zhì)量濃度為20 g/L的利多卡因麻醉，在穿刺探頭的引導(dǎo)下，上活檢栓，完成切割組織的動(dòng)作后，迅速拔針，穿刺點(diǎn)進(jìn)行消毒包扎。標(biāo)本經(jīng)質(zhì)量濃度為40 g/L的中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色、網(wǎng)織纖維染色和羅丹寧銅染色，封片后，由2名病理醫(yī)師閱片。

1.4基因組DNA的提取及引物設(shè)計(jì)采用全血基因組DNA提取試劑盒(DP348，天根生化科技有限公司)提取全血基因組DNA。實(shí)驗(yàn)方法如下：抽取WD組和健康對(duì)照組外周靜脈血各1 ml并抗凝，1～2.5倍血液樣品體積的細(xì)胞裂解液裂解，細(xì)胞核沉淀加入緩沖液和20 μl蛋白酶K(100 μg/ml)置56 ℃水浴鍋孵育10 min，混合液加入離心柱內(nèi)，離心，漂洗，加入50 μl的洗脫緩沖液，室溫靜置2 min，離心，收集DNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆?。使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物，Invitrogen公司合成所需要的引物。引物序列及反應(yīng)條件見表1。

1.5PCR反應(yīng)及測(cè)序反應(yīng)體系為25 μl，BIO-RAD PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃變性5 min，94 ℃熱變性15 s，從61 ℃開始復(fù)性，每進(jìn)行一個(gè)熱循環(huán)，復(fù)性溫度降低0.5 ℃，持續(xù)至55 ℃，復(fù)性時(shí)間為45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物5 μl加入質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠中，100 V電泳30 min，凝膠成像儀觀察PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物純化后，由天津金唯智公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 ATP7B基因的引物序列及擴(kuò)增條件Tab 1 Primers and amplication conditions of ATP7B gene

2 結(jié)果

2.1WD患者組織學(xué)表現(xiàn)以肝病為首發(fā)癥狀的WD患者具有程度不等的肝臟損傷，22例(48.9%)有脂肪變性，45例患者均有不同程度的肝纖維化，嚴(yán)重肝纖維化14例(31.1%)，其中，診斷為活動(dòng)性肝硬化4例(8.9%)，銅染色陽性患者39例(86.7%)。組織學(xué)改變相對(duì)特異，光鏡下可見肝細(xì)胞彌漫腫脹，部分肝細(xì)胞顯著氣球樣變，胞漿內(nèi)可見Mallory小體形成(見圖1A)；肝臟匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞觀察到數(shù)量較多的糖原性空泡核(見圖1B)；部分病例可進(jìn)展到肝硬化期，匯管區(qū)明顯擴(kuò)大，纖維組織增生形成假小葉(見圖1C)，網(wǎng)織纖維染色可見纖維間隔形成(見圖1D)。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)有過量的銅沉積時(shí),HE染色可見細(xì)胞內(nèi)有棕褐色脂褐素樣顆粒(見圖1E)，羅丹寧染色，可見肝細(xì)胞胞漿內(nèi)橘紅色銅顆粒沉積(見圖1F)。

2.2WD患者ATP7B基因突變位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)45例WD患者ATP7B基因外顯子突變位點(diǎn)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，第12和16號(hào)外顯子為高頻率的突變位點(diǎn)，最常見的突變類型為堿基替換。16號(hào)外顯子c.3419C>T(即Val1140Ala)突變頻率達(dá)30.2%，ATP7B基因在12號(hào)外顯子c.2855A>G位點(diǎn)(即Lys952Arg)的突變頻率也高達(dá)30.2%(見表2)。

2.3ATP7B基因新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)本研究共檢測(cè)到4種新發(fā)的突變位點(diǎn)，分別是位于8號(hào)外顯子CTC-TTC(即Leu732Phe)，突變頻率為1.7%(見圖2A)；位于11號(hào)外顯子GCG-CCG(即Ala874Pro)，突變頻率為0.6%(見圖2B)；位于13號(hào)外顯子CTG-CCG(即Leu989Pro)，突變頻率為0.8%(見圖2C)；位于13號(hào)外顯子CAG-TAG(即Gln1004Thr)，突變頻率為1.7%(見圖2D)。

圖1 WD患者組織學(xué)表現(xiàn) A：肝細(xì)胞腫脹，氣球樣變性(HE 400×)；B：肝細(xì)胞空泡樣變(HE 400×)；C：肝纖維組織增生，假小葉形成(HE 100×)；D：纖維間隔形成(網(wǎng)織纖維染色100×)；E：肝細(xì)胞胞漿內(nèi)棕褐色脂褐素樣顆粒(HE 400×)；F：肝細(xì)胞內(nèi)銅顆粒沉積(羅丹寧銅染色 400×)Fig 1 Histological appearance of WD patients A: liver cell swelling and ballooning degeneration (HE 400×); B: hepatocyte vacuolation (HE 400×); C: fibrous tissue hyperplasia of the live, false lobule formation (HE 100×)；D： fibrous septum formation (Gordon-Sweets 100×); E: deposition of lipofuscin in hepatocyte (HE 400×); F: copper deposition in hepatocyte (Rhodamine 400×)

表2 45例WD患者ATP7B基因突變位點(diǎn)Tab 2 ATP7B gene mutations in 45 Chinese WD patients

圖2 ATP7B基因突變患者的DNA測(cè)序圖 A：外顯子8突變位點(diǎn)Leu732Phe；B：外顯子11突變位點(diǎn)Ala874Pro；C：外顯子13突變位點(diǎn)Leu989Pro；D：外顯子13突變位點(diǎn)Gln1004Thr

3 討論

WD是由于ATP7B基因發(fā)生突變導(dǎo)致P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶發(fā)生障礙的遺傳性疾病。WD在中國人群中發(fā)病率更高，占單基因病的第2位。機(jī)體內(nèi)蓄積的銅可以沉積在肝臟、腦、眼角膜、腎臟、關(guān)節(jié)、心臟等器官，導(dǎo)致相應(yīng)的損傷。肝臟是銅代謝的主要器官，容易發(fā)生損傷，患者可以出現(xiàn)肝功能異常，甚至肝功能衰竭[8-9]。目前人類基因組數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)統(tǒng)計(jì)的ATP7B基因突變有500多種，但以少數(shù)幾種突變類型為主，且不同種族和地區(qū)基因突變類型不同，其中關(guān)于中國人群存在的突變有120多種。突變類型主要以錯(cuò)義突變?yōu)橹鳎笔?、插入和剪接突變較少見。對(duì)臨床疑似WD的患者進(jìn)行ATP7B基因突變位點(diǎn)檢測(cè)，可以盡早明確診斷，進(jìn)行干預(yù)治療，降低組織器官損傷的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)產(chǎn)前診斷和新生兒篩查具有重要意義[10]。

目前關(guān)于ATP7B基因突變的研究表明，不同地域人群中ATP7B基因的突變類型和突變頻率并不相同[11]。THOMAS等[12]首次報(bào)道了在歐洲人中WD患者His1069Gln(位于14號(hào)外顯子)和Gly1266Lys(位于18號(hào)外顯子)突變率較高，分別占總患者的28%和10%。研究[13]表明，歐洲人14和18號(hào)外顯子為突變熱區(qū)，同時(shí)還存在其他外顯子的眾多突變類型。在亞洲一項(xiàng)對(duì)印度患者的研究中發(fā)現(xiàn)，常見的突變有Cys271Stop(位于2號(hào)外顯子)和Arg778Leu(位于外顯子8)，突變頻率較高，這一點(diǎn)和歐洲等其他人群不同。針對(duì)臺(tái)灣的一項(xiàng)研究[14]也顯示，22例WD患者中有27%的患者出現(xiàn)了778密碼子突變，主要為Arg778Leu和Arg778Gln，此后陸續(xù)報(bào)道的突變分布在外顯子5、7、8、12、14、18。因?yàn)閃D患者基因突變類型和臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，導(dǎo)致突變類型和臨床表現(xiàn)的相關(guān)性還未得到證實(shí)，且這一疾病和患者的種族及地域都有相關(guān)性，導(dǎo)致基因突變和臨床表型的相關(guān)性并沒有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。但根據(jù)臨床癥狀來研究患者的基因突變類型對(duì)于發(fā)現(xiàn)WD的發(fā)病規(guī)律、疾病進(jìn)展及臨床治療有重要的參考意義。

本研究中的45例WD患者ATP7B基因測(cè)序結(jié)果顯示，共發(fā)現(xiàn)21個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中有17個(gè)突變位點(diǎn)為已知突變位點(diǎn)，另外4個(gè)為首次發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。其中位于12號(hào)外顯子的2855A>G和位于16號(hào)外顯子的3419C>T突變頻率最高，均達(dá)到30.2%。目前國內(nèi)學(xué)者普遍認(rèn)為，8號(hào)外顯子的2333G>T突變頻率最高，該突變被多次報(bào)道，這個(gè)位點(diǎn)突變后能夠改變ATP7B的基因結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能失效，銅離子蓄積。我們的研究結(jié)果顯示，2333G>T突變頻率為10.9%，是本研究中第三突變熱點(diǎn)，和以往的研究有所不同。位于12號(hào)外顯子2804C>T發(fā)生的錯(cuò)義突變一直認(rèn)為是我國WD患者的第二突變熱點(diǎn)，該位點(diǎn)突變后可導(dǎo)致ATP7B基因第五跨膜區(qū)蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致銅代謝障礙。本研究中2804C>T突變頻率沒有2855A>G高，表明該突變位點(diǎn)可以作為另一個(gè)值得關(guān)注的位點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，16號(hào)外顯子3419C>T突變頻率也很高，與國內(nèi)部分報(bào)道結(jié)果不符，這提示我們，中國WD患者基因突變除了主要發(fā)生在第8和第12外顯子上，16號(hào)外顯子的突變也要引起重視，極有可能也是中國WD患者的高頻突變位點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)的ATP7B基因突變位點(diǎn)與以往研究不同，可能是因?yàn)楸狙芯渴且愿尾槭装l(fā)癥狀的WD患者為研究對(duì)象，且不同地域、不同種族WD患者基因突變類型和臨床表現(xiàn)具有較大差異，另外不同個(gè)體差異及環(huán)境因素也會(huì)造成患者不同的基因突變類型和臨床表型。

我國以肝病為首發(fā)表現(xiàn)的WD患者除了外顯子8和12這兩個(gè)突變位點(diǎn)以外，16號(hào)外顯子也是一個(gè)重要的突變位點(diǎn)，另外，本研究還發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的錯(cuò)義突變，分別位于第8、11和13號(hào)外顯子上，由于這4個(gè)新的錯(cuò)義突變發(fā)生的頻率較低(0.8%～1.7%)，有關(guān)突變與臨床表型、地域等方面的相關(guān)性還需進(jìn)一步加大樣品量進(jìn)行分析。我國以肝病為首發(fā)癥狀的WD患者ATP7B基因突變是以少數(shù)幾個(gè)熱點(diǎn)突變和廣泛存在的罕見突變?yōu)樘卣?，不同地區(qū)、不同臨床癥狀的患者突變熱點(diǎn)并不一致。因此，對(duì)臨床上疑似WD患者盡早行ATP7B基因突變位點(diǎn)檢測(cè)，可以在早期對(duì)患者進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)和治療，改善患者的生活狀態(tài)和預(yù)后。

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