宋宗昌，郭春亮，唐家宏，朱 璐，申品穎，張 紅，韓懷忠，趙鵬飛

解放軍第一五五中心醫(yī)院腫瘤科/開封市血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475003

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，也是肝臟第二常見原發(fā)惡性腫瘤，約占全部肝臟原發(fā)腫瘤的10%，多數(shù)患者預(yù)后很差[1-2]。近年來，ICC發(fā)病率和死亡率有逐漸增高的趨勢(shì)，我國ICC的發(fā)病率占全球的一半以上 。ICC的治療方法仍以手術(shù)切除為主，由于我國人民的健康意識(shí)淡薄，常規(guī)體檢及腫瘤篩查工作相對(duì)落后，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，多數(shù)無法進(jìn)行手術(shù)治療，然而進(jìn)行R0切除的患者5年生存期為20%～40%,術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)75%[3]。ICC的發(fā)病機(jī)制及其發(fā)展的重要影響因素尚不明確，探索研究與ICC發(fā)生、增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要分子及相關(guān)機(jī)制有望為其預(yù)后判斷及臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11, PRR11)基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有癌基因潛能的基因，位于人類染色體17q22區(qū)[4]。文獻(xiàn)[5]報(bào)道，PRR11在一些腫瘤組織，如食管癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌及肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，而在其相應(yīng)癌旁組織中低表達(dá)，是患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素之一。PRR11與ICC的關(guān)系尚不明確，對(duì)ICC病理特征及患者臨床預(yù)后的影響尚未見報(bào)道。本研究通過組織芯片及免疫組化方法檢測(cè)PRR11在ICC及其癌旁組織中的表達(dá)情況，并探討其對(duì)ICC臨床病理特征的影響及其與ICC患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2003年1月至2008年12月在解放軍第一五五中心醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)病理確診為ICC的67例患者資料，包括癌組織石蠟標(biāo)本、相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊界>2 cm，經(jīng)病理證實(shí)無癌組織)石蠟標(biāo)本、臨床病理特征及隨訪資料(包括年齡、性別、T分期、N分期、TNM分期、分化程度及生存狀況)。所有患者術(shù)前、術(shù)后均未行放、化療。隨訪日期截止到2013年12月。所有組織標(biāo)本的獲得均得到患者的同意，簽訂知情同意書，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)許可。

1.2試劑和方法所有患者組織HE染色玻片均經(jīng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家鑒定并確診為ICC。根據(jù)報(bào)道方法[6]進(jìn)行組織微陣列構(gòu)建。從供體蠟塊取出1 mm組織柱，放入受體石蠟塊中，加熱融合。4 μm厚度連續(xù)切片貼到3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)預(yù)處理的玻片上。S-P法染色：經(jīng)過脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶滅活及I抗孵育、Ⅱ抗結(jié)合、顯色等過程?？贵w稀釋按下列方式進(jìn)行：兔抗人多克隆PRR11抗體(1∶100稀釋；美國Sigma-Aldrich公司，HPA023923)，免疫組化染色S-P試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；KIT-9710)顯色。蘇木素進(jìn)行復(fù)染。

1.3結(jié)果判定PRR11蛋白免疫組化染色結(jié)果由2位病理科專家分別在奧林帕斯CX31顯微鏡下觀察(日本Olympus公司)。免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]采用免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度相結(jié)合的方法綜合計(jì)算：細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無染色，1分為弱染色(淡黃色細(xì)顆粒)，2分為中染色(棕黃色顆粒)，3分為強(qiáng)染色(褐黃色粗顆粒)。腫瘤細(xì)胞陽性率評(píng)分：0分為0，1分為0～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為75%～100%。計(jì)算公式：兩者相乘≤3分為陰性，≥4分為陽性。每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野(400×)，取其均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ICC組織與癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)差異分析、PRR11蛋白表達(dá)與ICC臨床病理相關(guān)性分析均采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法對(duì)生存曲線進(jìn)行描述，并對(duì)PRR11蛋白表達(dá)陽性及陰性患者的生存差異進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PRR11蛋白表達(dá)情況67例ICC組織中有39例PRR11蛋白表達(dá)陽性，陽性率為58.2%，ICC組織中PRR11蛋白表達(dá)評(píng)分為7.15±3.58；癌旁組織中有8例PRR11蛋白表達(dá)陽性，陽性率為11.9%，癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)評(píng)分為2.28±1.27。ICC組織與癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

圖1 PRR11在ICC組織及癌旁組織中的表達(dá)(400×) A:癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)陽性; B：癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)陰性；C：ICC組織中PRR11蛋白表達(dá)陽性；D：ICC組織中PRR11蛋白表達(dá)陰性Fig 1 PRR11 expressions in ICC tissues and adjacent tissues (400×) A: positive expression of PRR11 in adjacent tissues; B: negative expression of PRR11 in adjacent tissues; C: positive expression of PRR11 in ICC tissues; D: negative expression of PRR11 in ICC tissues

2.2PRR11蛋白表達(dá)與ICC臨床病理特征的相關(guān)性分析PRR11蛋白表達(dá)陽性與癌組織的局部浸潤程度(P=0.001)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及TNM分期(P=0.009)有顯著相關(guān)性；而與患者年齡(P=0.085)、性別(P=0.052)及癌組織分化程度(P=0.530)無明顯相關(guān)性(見表1)。

2.3生存分析利用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，67例ICC患者的中位生存時(shí)間為29.4個(gè)月，PRR11蛋白陰性表達(dá)的ICC患者中位生存時(shí)間為41.0個(gè)月，PRR11蛋白陽性表達(dá)的ICC患者中位生存時(shí)間為20.3個(gè)月(見圖2)。PRR11蛋白陽性表達(dá)的ICC患者的預(yù)后明顯低于陰性表達(dá)患者(P=0.002)。

3 討論

ICC是指原發(fā)于肝內(nèi)膽管上皮的惡性腫瘤，占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%～15%，占膽管癌的5%～10%[8-9]。基于生長模式大體標(biāo)本分為3種類型：腫塊型、管周浸潤型及管內(nèi)生長型[10]。組織病理類型分為：腺癌、鱗癌、腺鱗癌、黏液表皮樣癌、未分化癌及類癌等，其中腺癌超過90%[11]。近年來，ICC發(fā)病率和死亡率有逐漸升高的趨勢(shì)。美國每年新發(fā)病例約8 000人，我國沒有系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)資料，據(jù)文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道，我國ICC的發(fā)病率約占全球的55%。目前，ICC治療仍以手術(shù)切除為主，根治性手術(shù)切除后5年生存率為8%～47%；行姑息性切除者，3年生存率為11%，5年生存率為0；其他治療或未治療者平均生存期為4～6個(gè)月[12-14]。ICC早期無明顯癥狀，多數(shù)患者在診斷時(shí)已失去了手術(shù)根治的時(shí)機(jī)，即使予以放療、化療、分子靶向藥物及最佳支持治療等，總體5年存活率仍低于5%[3]。

表1 PRR11蛋白表達(dá)與ICC患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation between expression of PRR11 and clinical pathology feature of ICC patients 比例/%

圖2 PRR11蛋白表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)性分析Fig 2 Analysis of correlation between expression of PRR11 and survival time

PRR11基因位于人類染色體17q22區(qū)，含有51 211個(gè)堿基，包括9個(gè)內(nèi)含子及10個(gè)外顯子，PRR11蛋白由360個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，相對(duì)分子量約40 kD[15-16]，包含1個(gè)二聯(lián)核定位信號(hào)，2個(gè)脯氨酸富集區(qū)域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc finger domain, ZFD)。該蛋白的作用靶標(biāo)可能為膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子等與腫瘤產(chǎn)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白及基因位點(diǎn)。文獻(xiàn)[5]報(bào)道，PRR11在一些腫瘤組織如食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌等組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)，是腫瘤預(yù)后不良的因素。

為進(jìn)一步了解PRR11蛋白表達(dá)與ICC的關(guān)系，我們收集了67例ICC患者的癌組織標(biāo)本、癌旁組織標(biāo)本、相關(guān)病理參數(shù)資料及相應(yīng)的臨床隨訪資料，研究了PRR11蛋白在ICC組織及癌旁組織中表達(dá)的差異、PRR11蛋白表達(dá)與ICC病理參數(shù)之間的關(guān)系，及其對(duì)ICC患者預(yù)后的影響。利用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRR11蛋白在ICC組織中高表達(dá)(39例，58.2%)，而在正常癌旁組織中低表達(dá)(8例，11.9%)，PRR11蛋白表達(dá)上調(diào)和ICC患者年齡、性別、癌組織分化程度無相關(guān)性，而與腫瘤局部浸潤、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有顯著相關(guān)性。我們利用隨訪資料進(jìn)行Kaplan-Meier方法生存分析顯示，PRR11蛋白高表達(dá)ICC患者較PRR11蛋白低表達(dá)患者的總生存期短。

上述研究結(jié)果說明，PRR11蛋白在ICC組織中高表達(dá)，并與癌細(xì)胞局部浸潤、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等病理特征顯著相關(guān)，PRR11蛋白高表達(dá)ICC患者生存期顯著短于PRR11蛋白低表達(dá)患者。提示PRR11蛋白高表達(dá)可能是ICC患者的獨(dú)立預(yù)后因素及ICC進(jìn)展的標(biāo)志物，檢測(cè)其表達(dá)水平對(duì)于判斷ICC患者的預(yù)后具有重要的臨床實(shí)踐意義，為靶向ICC中PRR11基因表達(dá)過程的治療提供理論基礎(chǔ)。

[1] CAI J Q, CAI S W, CONG W M, et al. Diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma: a consensus from surgical specialists of China [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2014, 34(4): 469-475. DOI: 10.1007/s11596-014-1301-5.

[2] ANDERSEN J B. Molecular pathogenesis of intrahepatic cholangiocarcinoma [J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2015, 22(2): 101-113. DOI: 10.1002/jhbp.155.

[3] UY B J, HAN H S, YOON Y S, et al. Laparoscopic liver resection for intrahepatic cholangiocarcinoma [J]. J Laparoendosc Adv Surg Tech A, 2015, 25(4): 272-277. DOI: 10.1089/lap.2014.0233.

[4] 宋宗昌, 郭長升, 趙鵬飛, 等. 下調(diào)PRR11表達(dá)抑制胃癌HGC-27細(xì)胞增殖和侵襲[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2016, 25(11): 1221-1224. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.004.

SONG Z C, GUO C S, ZHAO P F, et al. Knockdown of PRR11 expression inhibits proliferation and invasion in gastric cancer HGC-27 cells [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2016, 25(11): 1221-1224. DOI: 10. 3969/j. issn.1006-5709.2016.11.004.

[5] JI Y, XIE M, LAN H, et al. PRR11 is a novel gene implicated in cell cycle progression and lung cancer [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013, 45(3): 645-656. DOI: 10.1016/j.biocel.2012.12.002.

[6] MAKABE Y, SASAKI H, MORI G, et al. Comparison of gene expression in peri-implant soft tissue and oral mucosal tissue by microarray analysis [J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2015, 30(4): 946-952. DOI: 10.11607/jomi.3366.

[7] ZHAN C, YAN L, WANG L, et al. Identification of immunohistochemical markers for distinguishing lung adenocarcinoma from squamous cell carcinoma [J]. J Thorac Dis, 2015, 7(8): 1398-1405.DOI: 10.3978/j.issn.2072-1439.2015.07.25.

[8] BARTELLA I, DUFOUR J F. Clinical diagnosis and staging of intrahepatic cholangiocarcinoma [J]. J Gastrointestin Liver Dis, 2015, 24(4): 481-489. DOI: 10.15403/jgld.2014.1121.244.chl.

[9] ARIIZUMI S, YAMAMOTO M. Intrahepatic cholangiocarcinoma and cholangiolocellular carcinoma in cirrhosis and chronic viral hepatitis [J]. Surg Today, 2015, 45(6): 682-687. DOI: 10.1007/s00595-014-1031-0.

[10] HAYASHI A, MISUMI K, SHIBAHARA J, et al. Distinct clinicopathologic and genetic features of 2 histologic subtypes of intrahepatic cholangiocarcinoma [J]. Am J Surg Pathol, 2016, 40(8):1021-1030. DOI: 10.1097/PAS.0000000000000670.

[11] PARK S H, LEE S S, YU E, et al. Combined hepatocellular-cholangiocarcinoma: Gadoxetic acid-enhanced MRI findings correlated with pathologic features and prognosis [J]. J Magn Reson Imaging, 2017, 46(1): 267-280. DOI: 10.1002/jmri.25568.

[12] PADIA S A. Intrahepatic cholangiocarcinoma [J]. Tech Vasc Interv Radiol, 2015, 18(4): 227-235. DOI: 10.1053/j.tvir.2015.07.006.

[13] KIM H J, KIM J S, JOO M K, et al. Hepatolithiasis and intrahepatic cholangiocarcinoma: a review [J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(48): 13418-13431. DOI: 10.3748/wjg.v21.i48.13418.

[14] WEBER S M, RIBERO D, O’REILLY E M, et al. Intrahepatic cholangiocarcinoma: expert consensus statement [J]. HPB(Wxford), 2015, 17(8): 669-680. DOI: 10.1111/hpb.12441.

[15] LELE D S, TALAT S, KUMARI S, et al. Understanding the importance of glycosylated threonine and stereospecific action of Drosocin, a Proline rich antimicrobial peptide [J]. Eur J Med Chem, 2015, 92: 637-647. DOI: 10.1016/j.ejmech.2015.01.032.

[16] ZHANG C, ZHANG Y, LI Y, et al. PRR11 regulates late-S to G2/M phase progression and induces premature chromatin condensation(PCC) [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 458(3): 501-508. DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.01.139.