羅文峰，程喜平，王繼輝，許德清

（1.廣東省佛山市中醫(yī)院 皮膚科，廣東 佛山 528000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120；3.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院皮膚科，廣東 佛山 528000；4.廣東省中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120）

慢性蕁麻疹是以風(fēng)團(tuán)和瘙癢為主要臨床癥狀的自身免疫性皮膚疾病，病機(jī)及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。免疫球蛋白E（immunoglobulins-E，IgE）介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)以及Th1/Th2免疫應(yīng)答紊亂被認(rèn)為與慢性蕁麻疹的發(fā)病密切相關(guān)[1-2]。鹽酸非索非那是具有抗組胺活性的新型藥物，能夠拮抗組胺所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答紊亂；卡介菌多糖核酸是一類非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，具有抑制肥大細(xì)胞脫顆粒、與IgE抗體競爭性結(jié)合抗原的作用。已有研究報道，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸在慢性蕁麻疹的治療中展現(xiàn)出積極價值，但是關(guān)于該治療方案發(fā)揮治療作用的分子機(jī)制并不明確[3]。Toll樣受體（toll like receptor，TLR）是體內(nèi)重要的模式識別受體，參與免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)的調(diào)控。TLRs家族中的TLR2被證實與慢性蕁麻疹的發(fā)生有關(guān)[4-5]。在下列研究中，本研究分析奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸是否通過TLR2通路調(diào)節(jié)慢性蕁麻疹患者的免疫應(yīng)答。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月-2016年11月在佛山市中醫(yī)院皮膚科確診為慢性蕁麻疹的78例患者作為研究對象。其中，男性31例，女性47例；年齡15～52歲。所有患者均符合慢性蕁麻疹的診斷標(biāo)準(zhǔn)，近1個月未使用過糖皮質(zhì)激素和免疫制劑，排除合并其他自身免疫相關(guān)性疾病、肝腎功能障礙或感染性疾病及對抗組胺藥物過敏。收住院告知研究事項，取得患者知情同意后給予奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療。

1.2 治療方法

患者入組后給予奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療，方法如下：奧洛他定5 mg、口服、2次/d；卡介菌多糖核酸注射液0.7 mg、肌內(nèi)注射、3次/周。治療4周后根據(jù)療效酌情減量或停藥。

1.3 外周血TLRs表達(dá)量的檢測

治療前和治療后2、4及6周時，采集患者的外周血，加入淋巴細(xì)胞分離液后離心，吸取中間懸浮的外周血單個核細(xì)胞，PBS洗滌、離心2遍后加入Trizol裂解液并分離細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增的目的基因包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR9，內(nèi)參基因為GAPDH，根據(jù)擴(kuò)增曲線計算TLR2、TLR4、TLR7、TLR9的mRNA含量。

1.4 血清指標(biāo)的檢測

治療前和治療后2、4及6周時，采集兩組患者的外周血，室溫靜置20 min后離心，分離血清后采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定IgE、補(bǔ)體C3、C4、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；相關(guān)分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后外周血中TLRs的表達(dá)量

治療前和治療后2、4及6周時，外周血單個核細(xì)胞中TLR2 mRNA的含量隨治療時間趨勢遞減，各時間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TLR4、TLR7及TLR9的mRNA含量在治療過程中無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 治療前后血清中IgE、C3、C4含量比較

治療前和治療后2、4及6周時，血清中IgE的含量隨治療時間趨勢遞減，各時間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C3、C4 的含量隨治療時間趨勢遞增，各時間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 治療前后血清中Th1、Th2細(xì)胞因子含量比較

治療前和治療后2、4及6周時，血清中IFN-γ、IL-2的含量隨治療時間趨勢遞增，各時間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-4、IL-10的含量隨治療時間趨勢遞減，各時間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

外周血單個核細(xì)胞中TLR2的mRNA表達(dá)量與血清中IgE、IL-4、IL-10的含量呈正相關(guān)，與血清中C3、C4、IFN-γ、IL-2的含量呈負(fù)相關(guān)。見表4。

表1 治療前后外周血中TLRs mRNA表達(dá)量比較 （n =78，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與治療后2周比較，P ＜0.05；3）與治療后4周比較，P ＜0.05

治療時間 TLR2 TLR4 TLR7 TLR9治療前 1.08±0.15 1.03±0.13 1.06±0.11 1.03±0.15治療后2周 0.77±0.061） 1.06±0.12 1.02±0.14 0.96±0.11治療后4周 0.52±0.072） 0.98±0.11 0.97±0.12 1.01±0.13治療后6周 0.34±0.043） 1.05±0.14 0.98±0.09 1.05±0.12 F值 14.822 0.251 0.226 0.184 P值 0.000 0.184 0.174 0.232

表2 治療前后血清中IgE、C3、C4含量的比較 （n =78，g/L，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與治療后2周比較，P ＜0.05；3）與治療后4周比較，P ＜0.05

組別 IgE C3 C4治療前 126.69±17.85 0.92±0.11 0.32±0.06治療后2周 56.52±7.521） 1.07±0.121） 0.41±0.061）治療后4周 33.15±3.642） 1.23±0.151） 0.47±0.071）治療后 6周 27.65±3.613） 1.42±0.161）2）3） 0.52±0.071）2）F值 22.812 8.582 7.962 P值 0.000 0.001 0.003

表3 治療前后血清中Th1、Th2細(xì)胞因子含量的比較 （n =78，ng/L，±s）

表3 治療前后血清中Th1、Th2細(xì)胞因子含量的比較 （n =78，ng/L，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與治療后2周比較，P ＜0.05；3）與治療后4周比較，P ＜0.05

組別 IFN-γ IL-2 IL-4 IL-10治療前 11.32±1.52 25.58±3.36 7.64±0.93 10.36±1.42治療后2周 16.67±2.031） 32.71±4.46 4.58±0.65 7.32±0.92治療后4周 22.26±3.142） 39.42±5.12 3.32±0.46 5.57±0.71治療后6周 32.18±4.853） 52.42±6.58 2.71±0.32 4.21±0.56 F值 18.382 12.283 22.182 11.028 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 TLR2 mRNA表達(dá)量與血清指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

慢性蕁麻疹的發(fā)生與B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IgE以及CD4+T細(xì)胞中Th2亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4、IL-10有關(guān)。IgE能夠介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)，而IL-4和IL-10等細(xì)胞因子對IgE的產(chǎn)生具有正反饋效應(yīng)。已有研究報道，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)IgE、IL-4、IL-10的產(chǎn)生增多，會造成補(bǔ)體C3和C4的不斷消耗、抑制Th1亞群的分化成熟及細(xì)胞因子的分泌[6-7]。奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸是目前臨床上治療慢性蕁麻疹的常用方案，前者是一類抗組胺藥物，能抑制組胺所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制多種細(xì)胞因子的分泌和釋放[8]；后者是一類非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，能夠穩(wěn)定肥大細(xì)胞、與IgE競爭性結(jié)合肥大細(xì)胞上的抗原并抑制肥大細(xì)胞脫顆粒過程，同時也能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡、糾正Th1/Th2的失衡狀態(tài)[9]。國內(nèi)安國芝[3]的研究證實，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療慢性蕁麻疹能夠取得確切療效。

在慢性蕁麻疹的病情發(fā)展變化過程中，TLRs家族中的TLR2、TLR4、TLR7、TLR9均被證實與患者體內(nèi)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的紊亂有關(guān)，是造成慢性蕁麻疹發(fā)生以及病情發(fā)展的關(guān)鍵分子[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療能夠以時間依賴性的方式降低外周血單個核細(xì)胞中TLR2的mRNA含量，但是不會影響TLR4、TLR7、TLR9的mRNA含量。這說明奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療慢性蕁麻疹可能主要通過TLR2發(fā)揮作用。

IgE是介導(dǎo)慢性蕁麻疹患者體內(nèi)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的重要抗體，與肥大細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合后能夠造成肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而分泌組胺等介質(zhì)并引起蕁麻疹的臨床癥狀[10-11]。在IgE介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的過程中，補(bǔ)體C3和C4也發(fā)揮重要的協(xié)同作用并且會被不斷消耗[12]。相關(guān)臨床研究顯示，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)IgE的含量升高，而C3和C4的含量降低[13]。本研究結(jié)果顯示，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療能夠以時間依賴性的方式降低血清中IgE的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，以時間依賴性的方式增加C3和C4的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。這就說明奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療可能通過抑制TLR2的表達(dá)來減少IgE的分泌以及C3和C4的消耗。

在IgE介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的過程中，Th1和Th2細(xì)胞對體液免疫應(yīng)答過程以及自身抗體的分泌均具有調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞所分泌產(chǎn)生的IL-4、IL-10能夠介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，對B細(xì)胞的分化成熟以及IgE的分泌具有促進(jìn)作用；Th1細(xì)胞所分泌的IFN-γ、IL-2能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫，對Th2細(xì)胞的功能具有抑制作用。相關(guān)研究報道，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)Th1細(xì)胞的功能處于抑制狀態(tài)、Th2細(xì)胞的功能則增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療能夠以時間依賴性的方式增加血清中IFN-γ、IL-2的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，以時間依賴性的方式降低IL-4、IL-10的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)。表明奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療可能通過抑制TLR2的表達(dá)來調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應(yīng)答的平衡，抑制Th2免疫應(yīng)答、增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答。

綜上所述，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療可通過TLR2通路調(diào)節(jié)慢性蕁麻疹患者體內(nèi)的IgE所介導(dǎo)的Ⅰ型免疫應(yīng)答，同時也調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡。

參 考 文 獻(xiàn)：

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