蒙小麗 龍玲 陳小勇

[摘要]目的 構(gòu)建pH響應(yīng)性的口服甲氨蝶呤納米遞送系統(tǒng)，以提高甲氨蝶呤的口服生物利用度。方法 基于聚乙烯亞胺與甲氨蝶呤之間的多重非共價鍵作用力，采用透析法制備甲氨蝶呤納米粒，觀察測定其形貌、粒徑、電位、載藥性能等理化特征，并通過體內(nèi)外藥物釋放實驗初步評價該納米粒系統(tǒng)的pH響應(yīng)性及其口服生物利用度。結(jié)果 通過該法制備的甲氨蝶呤納米粒的粒徑均一、大小可控、表面帶正電荷，具有優(yōu)良的載藥性能及明顯的pH響應(yīng)性釋放行為。該納米粒在pH=1.2的環(huán)境中不釋放，而在pH=7.4的環(huán)境中可快速釋放。相較于甲氨蝶呤原料藥和片劑，甲氨蝶呤納米粒口服后血藥濃度達峰時間更短，峰濃度更高，并具有更大的藥時曲線下面積。結(jié)論 該納米?？娠@著提高甲氨蝶呤的口服生物利用度，并有望基于此增強甲氨蝶呤口服抗腫瘤活性，具有較好的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]納米粒；甲氨蝶呤；聚乙烯亞胺；口服給藥

[中圖分類號] R944.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）2（a）-0020-05

[Abstrcact]Obiective To construct pH-responsive oral Methotrexate （MTX） nanoparticles based polyethylenimine （PEI） for improving the oral bioavailability of Methotrexate.Methods MTX nanoparticles were prepared by dialysis with MTX and PEI based on multiple non-covalent interactions between them.Physicochemical characteristics of nanoparticles containing morphology，particle size，zeta potential，drug loading，and entrapment efficiency were observed and determined，and in vivo and in vitro drug release profiles were employed to evaluate the pH responsive release ability and the oral bioavailability of MTX/PEI nanoparticles.Results The nanoparticles were successfully prepared as discrete and uniform spheres with positive charges，which exhibited an excellent MTX loading performance，and an obvious pH responsive release behavior that no released in pH=1.2 solvent，but rapidly released in pH=7.4 solvent.Compared with the raw MTX and tablet of MTX，MTX/PEI nanoparticles showed a shorter peak time and higher peak concentration after oral administration，and also a larger area undercurve （AUC）.Conclusion Oral bioavailability of MTX is significantly improved by MTX/PEI nanoparticle system.Based on this，the MTX/PEI nanoparticlesystem is expected to significantly enhance the oral MTX antitumor activity with a good prospect in application.

[Key words]Nanoparticles；Methotrexate；Polyethyleneimine；Oral administration

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是一種細胞毒性藥物，被廣泛應(yīng)用于急性白血病、乳腺癌、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎、頭頸部腫瘤、骨腫瘤等多種惡性腫瘤疾病的治療[1]。作為葉酸類似物，MTX可通過抑制二氫葉酸還原酶，導(dǎo)致DNA的生物合成受阻，從而抑制腫瘤細胞的增殖，是其抗腫瘤的主要機制[1-5]。然而，由于上皮細胞的增殖較快，增殖周期較短（24～48 h），MTX在抗腫瘤增殖的同時，對上皮細胞的增殖同樣具有較強的抑制作用[6]。盡管MTX口服制劑較注射劑具有更加安全、方便、患者依從性高的特點，特別是對于減少注射化療藥物帶來的血管損傷具有十分積極的作用；然而，由于MTX對上皮細胞增殖的抑制，其與消化道上皮細胞的長時間接觸會導(dǎo)致嚴重的消化道反應(yīng)，易引起口腔炎、胃炎及消化道出血等，這是目前MTX口服應(yīng)用的主要障礙[7-8]。近年來，研究者為提高MTX的口服生物利用度與口服安全性，已通過應(yīng)用納米制劑取得了部分進展，但由于傳統(tǒng)納米粒的載藥性能較低，且無環(huán)境敏感性，對MTX口服生物利用度與安全性的提高仍十分有限[9-13]。

研究提示，聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）與吲哚美辛等羧基小分子藥物可通過氫鍵、靜電作用等多重非共價鍵作用力自組裝形成具有高載藥量的pH響應(yīng)性口服納米釋藥系統(tǒng)[14-16]。MTX為葉酸類似物，其與吲哚美辛相似，在化學結(jié)構(gòu)中含兩個羧基。顯然，MTX同樣有望與PEI之間通過靜電作用、氫鍵作用等自組裝形成具有pH響應(yīng)性的高載藥聚合物納米粒。本研究擬利用PEI和MTX之間的多重非共價鍵作用力來構(gòu)建具有高載藥量的pH響應(yīng)性的口服pH響應(yīng)性納米釋藥系統(tǒng)，并對其pH響應(yīng)性藥物釋放行為與體內(nèi)藥動學進行初步研究，探討其在MTX口服遞送中的應(yīng)用潛力。

1材料與方法

1.1材料

PEI（分子量為25 kDa，Sigma，美國），MTX（Sigma，美國，純度≥99%）；MTX片（上海信誼藥廠有限公司）；透析袋（截留分子量：3500 Da，北京經(jīng)科宏達生物有限公司）；DMSO（分析純，重慶科隆化工有限公司）；乙醇（分析純，重慶科隆化工有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2儀器

20A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；754型紫外分光光度計（上海丙林電子科技有限公司）；SXJQ-1型數(shù)顯直流無級調(diào)速攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)公司）；HZP-150型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；Nano-zs型激光粒度Zeta電位分析儀（美國Malvern公司）；BL3-120A超聲清洗器（上海比郎儀器有限公司）。

1.3納米粒的制備

稱取一定量的MTX與PEI，溶于1 ml二甲基亞砜中，轉(zhuǎn)移至透析袋中（MWCO=3500），透析袋放入水中透析，隔一定時間換取去離子水，透析24 h后，取出透析袋中溶液，冷凍干燥后即得MTX/PEI納米粒。

1.4納米粒的形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米粒的形態(tài)。納米粒粒徑與Zeta電位通過激光粒度Zeta電位分析儀測定。

1.5 MTX的載藥量及包封率測定

精密稱取10 mg納米粒凍干粉，采用乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中定容，定容后溶液于紫外分光光度計306 nm處以乙醇為空白測定吸光度，代入標準曲線計算其濃度。分別按公式（1）與（2）計算納米粒的載藥量和包封率。

載藥量（%）=組裝體中所含藥物量（mg）/組裝體總量（mg）×100% （1）

包封率（%）=載藥量（%）/理論載藥量（%）×100% （2）

1.6納米粒pH響應(yīng)釋放行為評價

按MTX與PEI按投藥重量比20/10制備MTX/PEI納米粒，透析后的溶液取0.5 ml轉(zhuǎn)移至透析袋中，先將其放入40 ml pH 1.2的PBS釋放介質(zhì)中進行體外釋放，每過一段時間從釋放介質(zhì)中取出4 ml，并補充4 ml新鮮釋放介質(zhì)。2 h后將40 ml釋放介質(zhì)全部取出，補充40 ml pH 7.4的PBS釋放介質(zhì)，定時取4 ml釋放介質(zhì)，并補充4 ml新鮮釋放介質(zhì)。稱取一定量的MTX原料藥，放入透析袋中，按上述方法進行pH響應(yīng)釋放行為的評價。不同時間點的藥物濃度通過紫外分光光度計在306 nm的測定波長下測定，并根據(jù)標準曲線計算甲氨喋呤的累積釋放量和累積釋放百分比，計算后繪制釋放曲線。

1.7納米粒的體內(nèi)藥物釋放動力學研究

SD雄性大鼠購置于第三軍醫(yī)大學動物實驗中心，體重200～250 g，灌胃前24 h禁食，分為MTX原料藥組、MTX片劑組和MTX/PEI納米粒組，每組SD大鼠4只。按MTX含量10 mg/kg給予大鼠灌胃，其中納米粒組中甲氨喋呤載藥量為57.2%?？诜辔附o藥后一定時間點取血，3000 r/min離心10 min后取血漿，加入茶堿內(nèi)標溶液 50 μl，渦旋10 s，加乙腈1 ml，渦旋60 s，16 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 ml置另一離心管中，60℃氮氣吹干，殘渣用流動相120 μl溶解，離心，上清液過濾后取20 μl進樣。血藥濃度的測定參照文獻報道的高效液相色譜法測定[17]，流動相為磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）-甲醇（82∶18）；檢測波長：306 nm 和254 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30℃。

1.8血藥濃度曲線下面積的計算

采用DAS 3.0軟件計算獲得，計算結(jié)果采用PASW 18.0軟件對兩組數(shù)據(jù)以獨立樣本t檢驗方法進行均值比較。

2結(jié)果

2.1納米粒的理化性能

圖1為不同投藥重量比下制備的MTX/PEI納米粒在透射電鏡下的形貌，可以看到MTX與PEI在5/10、10/10與20/10三個投藥重量比下均可形成粒徑均一、形態(tài)良好的球形納米粒。

進一步采用激光粒度Zeta電位分析儀對納米粒的粒徑及表面電位進行測定，可以發(fā)現(xiàn)納米粒的粒徑大小與投藥重量比成正比。隨著MTX/PEI投藥重量比的增加，納米粒的粒徑隨之增大。其中，投藥重量比5/10、10/10與20/10的MTX/PEI納米粒的粒徑分別為（124.1±0.402）nm、（133.5±1.732）nm與（178.7±0.400）nm（圖2A）。不同投藥重量比納米粒的PDI值分別為0.214±0.071、0.231±0.059、0.205±0.081，提示不同投藥重量比納米粒的粒徑分布均較為均一。對納米粒的Zeta電位測定發(fā)現(xiàn)，不同投藥重量比的納米粒表面均帶正電荷，提示在納米粒的表面主要由陽離子聚合物PEI構(gòu)成。同時，隨著MTX/PEI投藥重量比的增加，納米粒的zeta電位則隨之降低。MTX/PEI投藥重量比5/10、10/10與20/10的MTX/PEI納米粒的zeta電位分別為（68.2±6.00）mV、（63.3±1.4）mV與（58.2±1.06）mV（圖2B），這主要是由于甲氨喋呤在納米粒中所占比例增加，PEI的正電荷被MTX的負電荷中和更多。

2.2納米粒的載藥性能

納米粒的載藥量與包封率是評價納米粒載藥性能的重要指標，通過紫外分光光度計測定MTX/PEI納米粒的載藥量和包封率發(fā)現(xiàn)，MTX/PEI投藥重量比在5/10～20/10的范圍內(nèi)時，納米粒的載藥量及包封率與其的投藥重量比成正相關(guān)；當MTX/PEI投藥重量比為20/10時，其載藥量可高達到（56.3±7.49）%，包封率可達到（84.5±11.2）%（圖3），具有優(yōu)秀的載藥性能。

2.3 MTX/PEI納米粒的pH響應(yīng)性釋放行為

圖4為MTX/PEI納米粒在pH=1.2與pH=7.4介質(zhì)環(huán)境下的累積藥物釋放曲線，MTX/PEI納米粒在pH=1.2的釋放介質(zhì)中幾乎不釋放，當將其轉(zhuǎn)移至pH=7.4的釋放介質(zhì)中時，在24 h內(nèi)快速釋放超過90%；而MTX原料藥在pH=1.2釋放介質(zhì)中釋放速度高于納米粒，2 h內(nèi)釋放了20%左右的藥物，而在pH=7.4中釋放速度則顯著的低于納米粒，24 h內(nèi)僅釋放約70%的藥物（圖4）。

2.4 MTX/PEI納米粒的體內(nèi)釋放行為

圖5為MTX原料藥、MTX片劑與MTX/PEI納米粒經(jīng)口服給藥后在大鼠血漿中的藥時曲線。如圖所示，MTX/PEI納米粒經(jīng)口服后，較MTX原料藥與MTX片劑的吸收速度大大提高，其達峰時間更短，在給藥后160 min后即達到達峰濃度，其Cmax可達到（1.61±0.23）μg/ml，并在24 h均保持較高的血藥濃度（>0.8 μg/ml）。而MTX原料藥與MTX片劑在給藥后220 min后分別達到達峰濃度，其Cmax分別為（0.85±0.13）μg/ml與（1.13±0.25）μg/ml。

隨后，進一步采用DAS 3.0軟件對MTX原料藥、MTX片劑與MTX/PEI納米粒的口服生物利用度進行計算，MTX/PEI納米?？娠@著提高MTX的生物利用度，其AUC值可達到（118.4±13.5）μg/（L·h），而MTX原料藥與MTX片劑的AUC值則顯著低于MTX/PEI納米粒，分別為（37.9±5.66）μg/（L·h）與（65.4±3.91）μg/（L·h）（圖6）。

3討論

MTX是臨床上廣泛使用的小分子藥物，適用于急性白血病、乳腺癌、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎等腫瘤治療以及頑固性普通銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎等自身免疫病。其作用機制主要為抑制二氫葉酸還原酶而達到阻礙腫瘤細胞DNA合成，從而抑制腫瘤細胞的生長與繁殖。甲氨喋呤為葉酸類似物，分子結(jié)構(gòu)中含有2個羧基，為羧基小分子藥物，其中的羧基可與PEI之間的氨基發(fā)生靜電作用與氫鍵作用；同時MTX中的疏水基團則可與PEI的長碳鏈之間形成疏水作用，從而構(gòu)成了MTX與PEI之間的多重非共價鍵作用力。

本研究基于甲氨喋呤與PEI之間的多重非共價鍵作用力，成功制備了MTX/PEI納米粒。通過透射電鏡觀察，可以看到該納米粒形態(tài)良好，為非常均勻的球形顆粒，粒徑約為100 nm。通過激光粒度Zeta電位分析儀測定的粒徑分布結(jié)果與透射電鏡觀察結(jié)果相似，不同MTX/PEI投量重量比的納米粒其粒徑分布在70～100 nm，并且可通過投量重量比的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)納米粒粒徑的可控。由于PEI為陽離子聚合物，該納米粒表面帶正電荷。研究提示，腸道黏膜表面攜帶負電荷，表面帶正電荷的納米粒更易黏附于腸道黏膜，增加腸道對納米粒的攝取，因此，MTX/PEI納米粒的表面正電荷性質(zhì)有望幫助納米粒在口服給藥后黏附于腸道表面，從而增加腸道保留時間，提高藥物的吸收。傳統(tǒng)的納米粒通?；趩我坏娜跏杷饔昧M成，需要較多的聚合物組成來負載藥物，因此其載藥量通常較低[5，9-10]。MTX/PEI納米粒通過氫鍵、靜電作用等多重非共價鍵作用力組成，本研究結(jié)果顯示，其載藥量相對于傳統(tǒng)的MTX納米粒的載藥量有大幅提升，隨著投藥量的增加，載藥量呈上升趨勢，最高可達55%以上，包封率可達到85%以上，提示MTX與PEI通過多重非共價鍵相互作用構(gòu)建的納米粒具有優(yōu)秀的藥物負載能力。

最后，本研究對MTX納米粒的體外釋藥特性和體內(nèi)藥動學進行了初步探討。MTX的解離常數(shù)pKa=3.4、pH=1.2時MTX中的羧基處于質(zhì)子化水平，藥物與聚合物間強的非共價鍵相互作用力仍然存在，因此，MTX/PEI納米粒在pH=1.2的釋放介質(zhì)中幾乎不釋放。當納米粒處于pH=7.4的釋放介質(zhì)中時，MTX中的羧基處于解離狀態(tài)，破壞了藥物與聚合物間的氫鍵，導(dǎo)致了納米粒的解締合，MTX從而在pH=7.4的釋放介質(zhì)中能夠快速釋放，在24 h內(nèi)釋放即超過90%。隨后的體內(nèi)藥動實驗顯示，MTX/PEI納米粒其pH響應(yīng)性的藥物釋放行為可減少藥物在胃酸中的釋放，增加藥物在腸道中的釋放，從而相較MTX原料藥和MTX片劑顯著提高MTX的口服生物利用度[18]。另外，MTX/PEI納米粒生物利用度提高的機制還有可能是因其表面帶有正電荷，可吸附于帶負電荷的小腸黏膜層，從而使載藥組裝體較長時間停留在小腸，增加了腸道保留時間，進而促進了MTX的口服生物利用度[19]；同時，MTX/PEI納米粒灌胃后在小腸內(nèi)部分經(jīng)腸內(nèi)吞作用吸收進入全身循環(huán)，促進了MTX的吸收[20]。

綜上所述，MTX/PEI納米?？赏ㄟ^其pH響應(yīng)性釋放行為及腸道黏附能力，大幅提高MTX的口服生物利用度，有望增強MTX的口服抗腫瘤活性。同時，該納米粒具有優(yōu)良的載藥性能，相較于傳統(tǒng)納米粒具有一定應(yīng)用優(yōu)勢，且制備工藝簡單、粒徑均一、大小可控，為提高MTX的口服抗腫瘤活性奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)，有較好的應(yīng)用前景。

[參考文獻]

[1]Vella N，Aiello M，Russo AE，et al.Genetic profiling and ovarian cancer therapy （review）[J].Mol Med Rep，2011，4（5）：771.

[2]Huennekens FM.The methotrexate story：a paradigm for development of cancer chemotherapeutic agents[J].Adv Enzyme ReguL，1994，34（94）：397-419.

[3]羅華山.大劑量甲氨蝶呤治療兒童急性淋巴細胞白血病的臨床觀察[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19（5）：76-77.

[4]Jolivet J，Cowan KH，Curt GA，et al.The pharmacology and clinical use of methotrexate[J].New Engl J Med，1983，309（18）：1094.

[5]王璐璐，朱林，倪坤儀，等.HPLC研究甲氨喋呤磁靶向脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的組織分布[J].中國藥學雜志，2006，41（20）：1572-1575.

[6]Triantafyllou K，Vlachogiannakos J，Ladas SD.Gastrointestinal and liver side effects of drugs in elderly patients[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2010，24（2）：203-215.

[7]Norris MD，De Graaf D，Haber M，et al.Involvement of MDR1 P-glycoprotein in multifactorial resistance to methotrexate[J].Int J Cancer，1996，65（5）：613-619.

[8]Terada T，Hira D.Intestinal and hepatic drug transporters：pharmacokinetic，pathophysiological，and pharmacogenetic roles[J].J Gastroenterol，2015，50（5）：1-12.

[9]Abbasi MM，Jahanban-Esfahlan R，Monfaredan A，et al.Oral and Ⅳ dosages of Doxorubicin-Methotrexate loaded-nanoparticles inhibit progression of oral cancer by down-regulation of matrix methaloproteinase 2 expression in vivo[J].Asian Pac J Cancer，2015，15（24）：10705-10711.

[10]Paliwal R，Rai S，Vyas SP.Lipid drug conjugate （LDC） nanoparticles as autolymphotrophs for oral delivery of metho-trexate[J].J Biomed Nanotechnol，2011，7（1）：130-131.

[11]黃曉奇，李國慶.藥劑學新技術(shù)及其在改善藥物功效中的作用[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19（35）：23-24.

[12]何偉，洪怡.載藥納米粒制備的研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（14）：33-36.

[13]楊偉麗，王廣天，于輝，等.納米靶向給藥系統(tǒng)的研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（28）：32-35.

[14]Zhu Y，Che L，He H，et al.Highly efficient nanomedicines assembled via polymer-drug multiple interactions：tissue-selective delivery carriers[J].J Control Release，2011，152（2）：317-324.

[15]Zhou X，Li X，Mao T，et al.Facile engineering of nano- and microparticles via self-assembly of homopolymers[J].Soft Matter，2011，7（13）：6264-6272.

[16]Che L，Zhou J，Li S，et al.Assembled nanomedicines as efficient and safe therapeutics for articular inflammation[J].Int J Pharm，2012，439（1-2）：307-316.

[17]康斯丹，黃巧玲.HPLC測定人血清中甲氨蝶呤濃度[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2014，37（6）：738-741.

[18]Philip AK，Philip B.Colon targeted drug delivery systems：a review on primary and novel approaches[J].Oman Med J，2010，25（2）：79-87.

[19]Jubeh TT，Barenholz Y，Rubinstein A.Differential adhesion of normal and inflamed rat colonic mucosa by charged liposomes[J].Pharm Res，2004，21（3）：447.

[20]McClean S，Prosser E，Meehan E，et al.Binding and uptake of biodegradable poly-dl-lactide micro- and nanoparticles in intestinal epithelia[J].Eur J Pharm Sci，1998，6（2）：153-163.