辛樹權，李文君，時東方

(1.長春師范大學生命科學學院，吉林長春130032；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春 130062)

全球范圍約有9.32億公頃土地遭受鹽化和堿化[1-2]，鹽漬土壤生產的農作物產量和品質也會有所下降[3]，如何改良土壤結構提高農作物的抗鹽性成為當前重要的研究課題,而微生物改良土壤技術是其中之一。植物促生菌是一類益生菌類，它可以促進植物對礦質養(yǎng)分的吸收和利用，抵抗不良環(huán)境對植物的傷害，抑制有害微生物生長繁殖，促進植物生長發(fā)育[4]。產多胺細菌是植物促生菌的一種，它通過代謝產生外源多胺對植物生長產生影響[5]。多胺是一類低分子脂肪含氮堿并能調節(jié)植物生長的一種調節(jié)劑。多胺包括腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)和尸胺(Cadaverine)等[6]。對植物中多胺含量的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境脅迫可誘導植物體內大量多胺的積累，在穩(wěn)定細胞膜、核酸及蛋白質等大分子物質構象、清除活性氧、調節(jié)細胞離子平衡等方面起重要作用[7]；外源施加腐胺、亞精胺或精胺可顯著提高鹽脅迫下黃瓜葉片和根系中SOD、POD和CAT活性[8]，降低O2-產生速率、H2O2和MDA含量，緩解鹽脅迫對黃瓜的傷害[9-10]。

大豆是重要的糧食和油料作物，不僅是人類食用蛋白和油脂的主要來源，也是工業(yè)原料的重要來源[11]。近年來，我國科研工作者從多學科多角度探究了鹽脅迫對其生長發(fā)育的影響[12-13]，但大多數(shù)研究只限于單鹽脅迫對植物幼苗期生理指標的影響[14-16]。本實驗以大豆為實驗材料，通過在鹽脅迫下施用產多胺細菌ccx5，觀察大豆萌發(fā)及其幼苗生長情況，為產多胺細菌增強植株抗鹽性的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試種子：市售大豆種子吉育47(JY47),經0.1%氯化汞消毒1min后，用蒸餾水沖凈殘液，25℃催芽，待種子露白，挑選發(fā)芽一致的種子按一定的距離種植到滅菌的河沙中，自然光照培養(yǎng)。

1.1.2 供試菌株：產多胺細菌ccx5(經16s RNA序列鑒定為巨大芽孢桿菌(megaterium)，分離自吉林省農安縣龍王鄉(xiāng)西崗村的羊草根際，保存于長春師范大學微生物研究室，產多胺比例為:精胺∶亞精胺∶腐胺=0.93∶2.04∶0.50。用TBS液體培養(yǎng)基進行菌液培養(yǎng)，在28 ℃旋轉搖床200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，后用722分光光度計在無菌水中調整到菌液OD值為0.5備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度鹽脅迫下產多胺細菌ccx5對大豆種子發(fā)芽的影響實驗

設計兩組實驗：挑選大小均勻、無破損的大豆種子備用。CK組：用不同濃度NaCl(0，30，60，90，120,150 mmol·L-1)浸泡大豆種子，每個培養(yǎng)皿放30個大豆種子。菌處理組：NaCl濃度與CK組一致，但大豆種子經過產多胺細菌ccx5浸泡5min撈出瀝干水。每天觀察兩組大豆種子發(fā)芽情況，并從中選出適合的鹽濃度做鹽脅迫下大豆種子苗期生長實驗研究。

1.2.2 鹽脅迫下產多胺細菌ccx5對大豆幼苗生長的影響實驗

河沙洗凈并高溫滅菌冷卻后，裝入底部具孔的塑料盆(30cm×30cm×10cm)中。挑選發(fā)芽一致的種子按一定的距離種植到消毒的凈沙中(深約0.5cm)，自然光照培養(yǎng)，每盆20株。每個塑料盆為一個處理，共4組。A組：每天用120 mmol·L-1NaCl的Hoagland營養(yǎng)液處理，B組：用含120 mmol·L-1NaCl的Hoagland營養(yǎng)液和OD值為0.5的300 mL菌液處理，C組：用Hoagland營養(yǎng)液和OD值為0.5的300 mL菌液處理，CK組：用Hoagland營養(yǎng)液處理做對照組。

1.3 測定方法

1.3.1 發(fā)芽指標的測定

以胚根突破種皮1mm左右為測量標準，從第2天開始統(tǒng)計種子的發(fā)芽數(shù),共統(tǒng)計5天，并參考文獻[17]進行種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的計算。

1.3.2 生態(tài)指標

大豆植株株高和鮮重的測定：在大豆幼苗長到一定高度時，將其連根拔起并小心洗掉根上的沙子，晾干后稱量大豆幼苗的株高和鮮重，每組取20株。計算4組經不同處理的大豆幼苗的差異。

1.3.3 生理指標的測定

過氧化物歧化酶(SOD)活性：稱取大豆幼苗鮮葉片(去葉脈)0.5 g于預冷的研缽中，加入2 mL預冷的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.8)，冰浴下研磨成勻漿，加入磷酸緩沖液沖洗研缽，使最終體積為10 mL，于4 ℃下10500 r·min-1離心20 min，上清液即為SOD粗酶液[18]。

丙二醇(MDA)含量測定：分別測定上清液在450、532和600 nm處的OD值，以ΔEmm[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]計算[19]。

葉綠素含量的測定方法參考文獻[20]。

1.4 數(shù)據處理

實驗數(shù)據采用Spss19.0和Excel 2003進行統(tǒng)計學分析和圖表制做。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下產多胺菌對大豆種子萌發(fā)的影響

表1 不同NaCl濃度對大豆種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出鹽濃度很低時，對大豆種子的萌發(fā)影響較小，而且低鹽濃度可以刺激大豆種子的萌發(fā)。60 mmol·L-1的鹽濃度是種子發(fā)芽的最適濃度，但隨鹽濃度增加，大豆種子發(fā)芽率也下降[21]。經過產多胺細菌ccx5處理的大豆種子，低鹽濃度下和無鹽處理(CK組)發(fā)芽率沒有差異，隨著鹽濃度增加，菌處理組比CK組的發(fā)芽率提高，在鹽濃度為90 mmol·L-1和120 mmol·L-1時更加明顯。鹽脅迫下經過產多胺細菌ccx5處理過的大豆種子發(fā)芽率顯著提高。從中選出鹽濃度120 mmol·L-1進行鹽脅迫下產多胺菌對大豆種子幼苗生長研究實驗。

2.2 鹽脅迫下產多胺細菌ccx5對大豆幼苗的株高和鮮重的影響

由圖1和圖2表明，在實驗過程中，NaCl脅迫下幼苗發(fā)育受到了一定的抑制，降低了幼苗的株高和鮮重。不經產多胺細菌ccx5處理，對照組的株高和鮮重分別是鹽脅迫植株株高和鮮重的1.53倍(P<0.05)和1.38倍(P<0.05)。在NaCl脅迫下，經產多胺細菌ccx5處理下的大豆幼苗的株高和鮮重分別為非菌處理下的1.31倍(P<0.05)和1.10倍(P<0.05)。在非鹽脅迫下，經ccx5處理的大豆幼苗的株高和鮮重分別是對照組的1.15倍(P<0.05)和1.13倍(P<0.05)。實驗表明產多胺細菌ccx5處理的大豆對鹽脅迫有很強的適應性，但ccx5對非鹽脅迫下植株的生長無明顯促進作用。

圖1 不同處理大豆幼苗株高

圖2 不同處理大豆幼苗冠鮮重

注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 鹽脅迫下產多胺細菌ccx5對大豆幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素(chlorophyll)是一類與光合作用(photosynthesis)有關的重要色素。葉綠素從光中吸收能量，將二氧化碳轉變?yōu)樘妓衔锊Υ嫫饋恚~綠素越多則光合作用越強，植株生長越旺盛。圖3表明，對照組幼苗葉片中葉綠素的含量是鹽脅迫下未經產多胺細菌ccx5處理的2.50倍(P<0.05)，在鹽脅迫的作用下，經產多胺細菌ccx5處理組幼苗葉片的葉綠素含量是非菌處理組的1.84倍(P<0.05)，在非鹽脅迫作用下，產多胺細菌ccx5處理組幼苗葉片的葉綠素含量是對照組的1.21倍(P>0.05)，顯然在鹽脅迫下產多胺細菌ccx5可以調節(jié)植株的生理機制，減少鹽脅迫對植株光合作用的影響。說明在高鹽脅迫下加入產多胺細菌ccx5緩解鹽對植物中葉綠素合成的影響,降低了對植物生長的傷害。

圖3 不同處理大豆幼苗葉片葉綠素含量

圖4 不同處理大豆幼苗葉片中SOD含量

2.4 鹽脅迫下產多胺細菌ccx5對大豆幼苗SOD酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內常見的一種酶，在逆境脅迫下能有效清除代謝過程產生的活性氧，防止活性氧引起的膜脂過氧化及其它傷害過程[22]，圖4表明鹽脅迫下ccx5處理的大豆幼苗葉片SOD活性是對照組的2.80倍(P<0.05)，鹽脅迫下,ccx5處理組的大豆幼苗葉片中的SOD活性是非產多胺細菌處理組的2.20倍(P<0.05)，非鹽脅迫下，多胺活性細菌ccx5處理組的大豆幼苗葉片的SOD活性是對照組的1.30倍(P<0.05)。表明鹽脅迫下植株葉片中SOD活性明顯提高，且ccx5可以提高鹽脅迫下葉片中的SOD活性。

2.5 鹽脅迫下產多胺細菌ccx5對大豆幼苗MDA含量的影響

MDA是植物體內自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應的終產物，能引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性[23]。MDA的含量可反映植物的受害程度。從圖5可以看出，在沒有ccx5參與下，鹽脅迫使幼苗葉片中的MDA含量明顯提高，是對照組的2.80倍(P<0.05)。在鹽脅迫下，非產多胺細菌處理組幼苗葉片中的MDA是產多胺細菌ccx5處理組的1.53倍(P<0.05)。非鹽脅迫條件下，產多胺細菌ccx5的處理與對照組無顯著差異(P>0.05)。表明高鹽脅迫下加入產多胺細菌ccx5降低了植物葉片MDA的含量，減少了對植物細胞的傷害，間接促進了植物的生長。

圖5 不同處理大豆幼苗葉片中MDA含量

3 討論

大豆幼苗對鹽是敏感的，而鹽分脅迫對大豆幼苗最普遍、最顯著的效應是抑制生長[24]。幼苗被轉移到鹽逆境中幾分鐘后，生長速率即有所下降，其下降程度與根際滲透壓呈正比[25]。本實驗表明鹽脅迫一定程度上抑制種子的發(fā)芽，影響種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等指標，影響程度與鹽濃度呈正相關，輕度脅迫下有促進作用，而高濃度鹽脅迫下發(fā)芽率等指標降低。低濃度的NaCl能促進大豆種子的萌發(fā)，而高濃度的NaCl則對大豆種子的萌發(fā)有顯著抑制作用[26-28]。關于ACC脫氨酶細菌對植物發(fā)芽的研究報導較多[29-30]，而產多胺細菌的相關研究報導較少[5]。加入了產多胺菌ccx5后大豆種子在高鹽脅迫下受到的發(fā)芽抑制得到緩解，說明產多胺細菌ccx5對大豆的發(fā)芽有促進作用。

鹽脅迫處理組的大豆幼苗株高和鮮重有明顯的降低，說明120 mmol·L-1NaCl溶液對植株幼苗的生長發(fā)育有抑制作用。這些抑制作用通過多種形式表現(xiàn)出來。鹽脅迫下，植物體內積累較多的活性氧，這些活性氧若不及時清除可能引起膜脂過氧化和脫酯化作用，細胞膜透性增加，細胞膜的結構和功能受到破壞[31]。SOD是植株內有效的活性氧清除劑，其活性在鹽脅迫條件下均高于正常水平，它們協(xié)同作用清除體內過多的ROS，有效阻止MDA的積累，抵抗鹽脅迫誘導的氧化傷害。本實驗結果表明，由于植物受到鹽分的脅迫，幼苗中的MDA含量明顯提高，而且植物為了提高抗鹽性，使其抗氧化酶活性增強。本文中鹽脅迫實驗大豆葉片SOD含量增加，加入產多胺菌大豆幼苗葉片SOD含量減少，從而間接地增加了大豆幼苗的抗鹽性，促進大豆幼苗的生長。這與江行玉[32]等通過外源葉面噴施spm的方法抑制MDA積累的研究結果及林慶斌等[33]加入氨基酸類物質提高了水稻體內SOD含量緩解了鹽害作用相似。

刁豐秋[34]等的研究表明鹽脅迫下NaCl提高了葉綠素酶的活性，從而加快了葉綠素的降解，在120 mmol·L-1NaCl脅迫下，大豆幼苗葉片中的葉綠素含量有明顯降低。鹽脅迫使植物葉片中葉綠素含量下降[35-37]，可能是由于Chl酶活性增強，促進葉綠素分解[38]或者由于在鹽脅迫下，植物葉片細胞中葉綠素與葉綠體蛋白間結合變得松馳，使更多的葉綠素遭到破壞[39]，葉片中的葉綠素含量降低。本研究加入了產多胺細菌ccx5后葉綠素的含量明顯增加，間接提高了大豆種子的萌發(fā)及抗鹽性，這與劉俊等[40]報導的多胺緩解鹽對玉米鹽害作用，提高了玉米葉片的光合能力相似。但加入菌后具體是對葉綠素合成過程的哪一環(huán)節(jié)產生影響還有待進一步研究。

多胺與植物的生存密切相關。環(huán)境脅迫能夠誘導植物體內積累大量的多胺，多胺含量增加對穩(wěn)定細胞膜、核酸及蛋白質等大分子物質有重要作用[41-42]。在本實驗中，經產多胺細菌ccx5處理的大豆幼苗的鮮重、葉片葉綠素含量、SOD活性有明顯的提高，但MDA的含量有所下降，表明了產多胺細菌ccx5產生的多胺可以通過增加植物體內的各種抗氧化酶的活性，降低了活性氧的含量，從而降低了氧化脅迫對植物的傷害，間接達到促進植物生長的作用。而產多胺菌對大豆生長促進的具體機理還需要進一步研究。

4 結論

在鹽脅迫下，植物的生長情況和植物體內的抗氧化酶的活性有密切的關系，較高水平的抗氧化酶活性可以降低植物體內活性氧的含量，有效地阻止鹽脅迫對植物的傷害，提高植物的抗鹽性。多胺活性細菌可以通過產生多胺物質來參與植物體的氧化代謝，提高植物體內抗氧化酶的活性，增強植物耐鹽性。

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