陳 薇，陳 靖，游 佳，朱月永，鄭 琦

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝病中心肝內(nèi)科，福建福州 350005)

肝癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤。隨著肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，患者遭受的痛苦逐漸加大直至威脅生命[1]。近年來(lái)，對(duì)肝癌患者如何作出準(zhǔn)確診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)越來(lái)越引起人們的關(guān)注。有學(xué)者指出，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase -9, MMP-9)與惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。而磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)能夠?qū)δ[瘤血管產(chǎn)生影響，同時(shí)在肝細(xì)胞癌中，gypican-3能夠通過(guò)與MMP9結(jié)合以及與其他生長(zhǎng)因子相關(guān)通路的相互作用而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[3]。本研究檢測(cè)肝癌組織中MMP-9及glypican-3的表達(dá)并分析其臨床病理價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年3月至2016年7月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)診斷為原發(fā)性肝癌的患者97例為肝癌組，所有對(duì)象在行外科手術(shù)前均未接受放化療及免疫等治療方案，男83例，女14例；平均年齡(48.24±13.15)歲，病理類型[4]等資料見(jiàn)表1。60例健康志愿者為對(duì)照組，均從健康體檢者中選取，組織經(jīng)肝穿刺獲得，男51例，女9例；平均年齡(49.46±12.98)歲。入組患者及對(duì)照組人員均簽署知情同意書，臨床實(shí)驗(yàn)方案得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的審核及批準(zhǔn)。

表1肝癌組患者的一般資料

Tab.1 Basic information of the observation group

項(xiàng)目腫瘤直徑(cm)<5≥5病理類型肝細(xì)胞癌膽管細(xì)胞癌其他腫瘤分化程度高低有無(wú)乙肝有無(wú)有無(wú)癌栓有無(wú)例數(shù)851282510554280173364

1.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP-9及glypican-3表達(dá)本研究中肝癌患者組織樣本為97例，健康志愿者肝臟樣本為60例，全部組織均使用免疫組化方法檢測(cè)MMP-9和glypican-3的表達(dá)。所有研究對(duì)象肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋制作組織切片，脫蠟水化，雙氧水進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的封閉處理，水洗后浸入磷酸鹽緩沖液中5 min×2次。用磷酸鹽緩沖液稀釋的山羊血清(100 mL/L)封閉，室溫孵育10 min后，棄血清，不水洗并分別加入MMP-9及glypican-3一抗工作液(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。用磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次；再加入適量生物素標(biāo)記二抗工作液(1∶5 000)，37 ℃孵育30 min。用磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。顯色劑進(jìn)行顯色3～15 min，再用潔凈水水洗，復(fù)染、脫水、透明、封片。采用常規(guī)方法統(tǒng)計(jì)評(píng)估[4]MMP-9及glypican-3的組化結(jié)果。

1.3MMP-9及glypican-3表達(dá)與臨床病理的關(guān)系觀察MMP-9及glypican-3表達(dá)變化與肝癌組肝癌臨床特征之間的關(guān)系，包括腫瘤直徑、分化程度、肝癌癌栓、甲胎蛋白(AFP)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組計(jì)量結(jié)果比較采用單樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)與計(jì)量資料均使用四聯(lián)表格式表示，使用χ2檢驗(yàn)比較

臨床指標(biāo)的診斷特異性及敏感性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組MMP-9、glypican-3表達(dá)的比較免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌組患者的MMP-9、glypican-3表達(dá)陽(yáng)性率和表達(dá)評(píng)分顯著高于對(duì)照組(圖1，表2，P<0.05)。

圖1免疫組化法檢測(cè)肝癌組與對(duì)照組中MMP-9與glypican-3的表達(dá)

Fig.1 Expressions of MMP-9 and glypican-3 in control and observation groups detected by immunohistochemistry

表2肝癌組與對(duì)照組中MMP-9與glypican-3表達(dá)的比較

Tab.2 Comparison of the expressions of MMP-9 and glypican-3 in control and observation groups detected by immunohistochemistry

組別例數(shù)MMP?9陽(yáng)性[n(%)]表達(dá)評(píng)分(分)glypican?3陽(yáng)性[n(%)]表達(dá)評(píng)分(分)肝癌組9746(47．42)1．95±1．6158(59．79)2．21±1．71對(duì)照組60005(8．33)0．83±1．23χ2或t值 7．8322．6225．3812．315P值 0．0070．0090．0210．026

2.2肝癌組MMP-9及glypican-3表達(dá)與臨床特征的關(guān)系肝癌組的MMP-9及glypican-3的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑、肝癌分化情況、有無(wú)肝癌癌栓不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(表3，P>0.05)。

表3肝癌組MMP-9及glypican-3表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

Tab.3 Relation of MMP-9 and glypican-3 expressions with clinical characteristics in the observation group

臨床特征例數(shù)MMP?9[n(%)]glypican?3[n(%)]性別 男8336(43．37)▲44(53．01)▲ 女148(57．14)11(78．57)年齡(歲) ≤502516(64．00)14(56．00)▲ >507220(27．78)43(59．72)腫瘤直徑(cm) <58529(34．12)▲73(85．88) ≥5124(33．33)7(58．33)腫瘤分化 高5527(49．09)▲30(54．55)▲ 低4217(40．48)16(38．10)肝癌癌栓 無(wú)6430(46．88)▲26(40．63)▲ 有3314(42．42)12(36．36)甲胎蛋白 陽(yáng)性7639(51．32)▲44(57．89)▲ 陰性218(38．10)13(61．90)

與同特征對(duì)應(yīng)組比較，▲P>0.05。

3 討 論

MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，對(duì)于由多糖和蛋白構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)產(chǎn)生降解作用，使細(xì)胞正常部分遭受損害，因而有利于癌細(xì)胞的侵入、襲擊和遷移[5]。而glypican-3可誘發(fā)腫瘤血管生成，并且還使血管通透性增加，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到周邊血管及組織中[6]；同時(shí)glypican-3與肝癌的進(jìn)展以及患者的預(yù)后顯著相關(guān)。因此，glypican-3作為一種肝癌的標(biāo)記物越來(lái)越受到關(guān)注。WANG等[7]的研究證實(shí)，在具有肝硬化背景的肝癌中，GPC3的陽(yáng)性率接近90%，在高分化肝癌組織中GPC3陽(yáng)性率達(dá)到48%，而在良性結(jié)節(jié)以及低分化肝癌組織中僅為3%。Meta分析顯示，GPC3在接受肝癌檢查的受試者中，曲線下面積(AUROC)達(dá)到0.928，甚至高于現(xiàn)有的肝癌標(biāo)記物AFP的0.869[8]。glypican-3與MMP9之間的關(guān)聯(lián)已有報(bào)道，如乳腺癌中外源性的TGF-β能夠通過(guò)glypican-3調(diào)節(jié)MMP-9酶的活性[9]；肝癌中GPC3基因高表達(dá)的患者癌癥細(xì)胞EMT顯著增強(qiáng)，同時(shí)，MMP-9作為EMT的標(biāo)記物之一也有顯著升高，而且GPC3與MMP9、β-catenin等EMT標(biāo)記物之間的表達(dá)呈正相關(guān)[10]。總的來(lái)說(shuō)，目前對(duì)于MMP-9與GPC-3之間的關(guān)聯(lián)主要集中于對(duì)EMT作用的探討，而MMP-9以及GPC-3的表達(dá)對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展以及與已知的癌癥標(biāo)記物之間的關(guān)聯(lián)則尚未有報(bào)道。

本研究的免疫組化結(jié)果中，細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒即認(rèn)為MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野，視野中陽(yáng)性細(xì)胞的比例小于5%即認(rèn)為樣本為陰性。肝癌組患者的MMP-9陽(yáng)性率和表達(dá)評(píng)分遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組的MMP-9表達(dá)例數(shù)為0，即在非肝癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9不表達(dá)。有研究指出，MMP-9蛋白在很多惡性腫瘤組織中表達(dá)，參與了一些惡性腫瘤的形成[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了MMP-9蛋白在肝癌的形成、變化中有一定的作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)肝癌組患者的MMP-9表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑、肝癌分化情況、有無(wú)肝癌癌栓，不具有相關(guān)性(P>0.05)?？赡艿脑蛟谟贛MP-9在肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移過(guò)程中，以不同的方式、路徑發(fā)揮著作用[12]。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及MMP-9的特點(diǎn)，可以將其用做檢測(cè)肝癌患者早期狀況的指標(biāo)，并且MMP-9指標(biāo)的靈敏度、準(zhǔn)確度較好。

肝癌組患者的glypican-3陽(yáng)性率和表達(dá)評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組glypican-3陽(yáng)性表達(dá)率為8.33%，雖有表達(dá)但低于肝癌組織。近來(lái)很多學(xué)者關(guān)注glypican-3與腫瘤的研究[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組患者的glypican-3表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑等特征不具有明顯關(guān)系(P>0.05)，說(shuō)明glypican-3與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而對(duì)于如何在腫瘤細(xì)胞的侵入遷移過(guò)程中發(fā)揮作用，尚存在疑問(wèn)[14]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了在高或中分化、低分化的不同病理分級(jí)中，glypican-3的表達(dá)不具有相關(guān)性(P>0.05)，提示可能在肝癌細(xì)胞的增殖分化中，glypican-3作用較小[15]。

綜上所述，MMP-9及glypican-3在肝癌組織中表達(dá)具有一定的臨床病理價(jià)值。MMP-9可用做檢測(cè)肝癌患者早期狀況的指標(biāo)，glypican-3在肝癌組織中高表達(dá)也有一定的檢測(cè)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫燕，屠紅，陸培新，等. 肝癌家族史與肝癌關(guān)系的20年前瞻性隊(duì)列研究[J].中華肝臟病雜志, 2014, 22(10):752-756.

[2] WU Y, LIU H, WENG H, et al. Glypican-3 promotes epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells through ERK signaling pathway[J]. Int J Oncol, 2015, 46(3):1275-1285.

[3] AKUTSU N, YAMAMOTO H, SASAK S, et al. Association of glypican-3 expression with growth signaling molecules in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2010, 28, 16(28):3521-3528.

[4] 胡建新，劉秀頎，李德民，等. 肝癌門靜脈癌栓影像學(xué)分型與臨床病理分型的對(duì)比研究[J]. 河北醫(yī)藥, 2015, 44(1):88-89.

[5] MEHNER C, HOCKLA A, MILLER E, et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(9):2736-2749.

[6] 陳會(huì)枝，李晨飛，王曉慧，等. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2015, 32(10):2599-2601.

[7] WANG XY, DEGOS F, DUBOIS S, et al. Glypican-3 expression in hepatocellular tumors: diagnostic value for preneoplastic lesions and hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol, 2006, 37(11):1435-1441.

[8] HUSSEIN TD. Serological tumor markers of hepatocellular carcinoma: A meta-analysis[J]. Int J Biol Markers,2015, 24, 30(1):e32-42.

[9] QI XH, WU D, CUI HX, et al. Silencing of the glypican-3 gene affects the biological behavior of human hepatocellular carcinoma cells[J]. Mol Med Rep, 2014, 10(6):3177-3184.

[10] LIU Y, ZHENG D, LIU M, et al. Downregulation of glypican-3 expression increases migration, invasion, and tumorigenicity of human ovarian cancer cells[J]. Tumour Biol, 2015, 36(10):7997-8006.

[11] 趙旭，胡衛(wèi)列，聶奇?zhèn)?，? 腎上腺皮質(zhì)腫瘤中E-cadherin、MMP-2及MMP-9的表達(dá)及意義[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2016,37(23):3527-3530.

[12] HUANG D, LIU D, SUN M, et al. Expression of matrix metalloproteinase -9 and phosphatidylinositol proteoglycan-3 in primary hepatocellular carcinoma (HCC)[J]. Chin J Exp Surg, 2016, 33(9):2200-2202.

[13] 劉愛(ài)玲，田芝奧，王欣霖，等. 精氨酸酶-1、肝細(xì)胞抗原和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表達(dá)在肝癌中的意義[J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志, 2015, 25(5):310-311.

[14] 夏麗潔，張富春. 肝癌治療新靶點(diǎn)GPC3研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016, 32(11):1486-1489.

[15] YU C, HUANG H, YANG SL et al. Meta analysis of the diagnostic value of combined detection of phosphatidylinositol proteoglycan-3 and AFP in primary liver cancer[J]. Chin J Hepatobiliary Surg, 2014, 20 (8):566-571.