蘇新喆，趙吉生，高永建，丁大勇

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃腸結(jié)直腸肛門外科,吉林 長春130033)

胃腸間質(zhì)瘤(GIST)，是起源于消化道的最常見的軟組織肉瘤。病理診斷，尤其是免疫組織化學(xué)檢測是確診GIST的唯一手段。因?yàn)镚IST質(zhì)脆，活檢過程中容易導(dǎo)致腫瘤出血和播散，因此GIST在術(shù)前診斷存在困難[1]。建立一種實(shí)時、無損、準(zhǔn)確、客觀的胃腸道間質(zhì)瘤術(shù)前診斷方法具有極其重要的意義。近紅外線激光拉曼光譜技術(shù)是一種以物質(zhì)特定的分子振動光譜來識別不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)的無損檢測技術(shù)。近年來，拉曼光譜技術(shù)成為研究生物物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的有效手段。本文采用近紅外拉曼光譜檢測、免疫組化等方法檢測胃腸道間質(zhì)瘤組織，對拉曼光譜檢測在胃腸道間質(zhì)瘤診斷的應(yīng)用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

收集到中日聯(lián)誼醫(yī)院胃腸外科2011年-2015年胃腸道間質(zhì)瘤術(shù)后腫瘤腫物及正常腸組織(距離病灶邊緣2 cm以上)52份，其中胃間質(zhì)瘤組織40份，小腸間質(zhì)瘤組織10份，直腸間質(zhì)瘤組織2份。組織樣本離體后用生理鹽水清洗3遍，每一份組織樣品均分成兩份，每份大小約0.5 cm3，一份放入10%福爾馬林溶液固定，然后行常規(guī)石蠟包埋，制備成10 μm厚的連續(xù)切片，并行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色，病理證實(shí)；另一份放入凍存管中，放入液氮罐中保存。本研究納入的患者未行術(shù)前靶向治療，標(biāo)本收集經(jīng)患者及家屬術(shù)前知情同意。

兔抗人CD117、DOG1單克隆抗體購自Life Science INC；辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗購自Amersham Pharmacia。實(shí)驗(yàn)儀器激光共焦顯微鏡InVia+Plus型顯微拉曼光譜儀(英國Renishaw 公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本置入10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋。石蠟標(biāo)本10 μm厚連續(xù)切片,置56℃烤箱中干烤2小時，冷卻后切片脫蠟，水化后用PBS沖洗。將組織切片放入裝有0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)的盒子中，微波爐中加熱至沸騰，維持5分鐘，自然冷卻。每張切片加1滴過氧化酶阻斷液，對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行滅活。滅活后用PBS沖洗。除去PBS液，每張切片加5%小牛血清，室溫下孵育5分鐘。除去血清，每張切片加1滴一抗(CD117抗體濃度1∶1 500，DOG1抗體濃度1∶1 000)，4度冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS沖洗后切片加二抗(1∶1 000)，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗。除去PBS液，DAB顯色。

1.2.2拉曼光譜分析 將裝有組織樣品的凍存管從液氮罐中取出，置于室溫下解凍半小時，再用無菌鑷將樣品從凍存管中取出，表面處理平整后置于載玻片上，把載玻片連同組織樣本放在樣本臺上。調(diào)節(jié)兩個開關(guān)使自然光照到樣品上；調(diào)節(jié)控制器移動樣品臺；調(diào)節(jié)焦點(diǎn)位置，使焦點(diǎn)聚集到組織樣品上；調(diào)節(jié)允許激光通過，屏蔽白光，按預(yù)定設(shè)置的參數(shù)獲取不同波數(shù)下的拉曼光譜，重復(fù)采集。光譜圖輸入計(jì)算機(jī)，再運(yùn)用Origin8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖譜處理。

1.2.3統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。繪圖采用Origin8.5繪圖軟件。

2 結(jié)果

2.1 胃腸道間質(zhì)瘤組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析

將PBS 作為陰性對照,CD117和DOG1蛋白陽性表達(dá)率分別為96.1%(50/52)，94.2%(49/52)。DOG1、CD117 陽性染色主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)(圖1)。CD117和DOG1蛋白表達(dá)與胃腸道間質(zhì)瘤危險度分級無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見表1)。

2.2 拉曼光譜分析結(jié)果

2.2.1胃腸道間質(zhì)瘤和正常對照組織的拉曼光譜比較 為明確胃腸道間質(zhì)瘤和正常對照組織的拉曼光譜是否有明顯差異，我們對44例胃腸道間質(zhì)瘤組織標(biāo)本和正常對照進(jìn)行了拉曼光譜檢測。結(jié)果顯示胃腸道間質(zhì)瘤組織在1 656 cm-1、1 452 cm-1處出現(xiàn)兩個拉曼峰，而正常對照組織在1 452 cm-1不存在拉曼峰(圖2)。說明拉曼位移1 452 cm-1是胃腸間質(zhì)瘤組織的特征性拉曼峰。

圖1 胃腸道間質(zhì)瘤組織的HE染色和免疫組織化學(xué)染色

CD117(+)DOG1(+)NIH分級低風(fēng)險16/1615/16中風(fēng)險5/55/5高風(fēng)險29/3129/31

2.2.2分析組織拉曼光譜檢測結(jié)果與危險度分級之間的關(guān)系 為明確胃腸道間質(zhì)瘤組織的拉曼光譜是否與危險度分級有關(guān)，我們對胃腸道間質(zhì)瘤低度惡性潛能組織標(biāo)本和高度惡性潛能標(biāo)本各15例進(jìn)行了拉曼光譜檢測。結(jié)果顯示兩組之間1 656 cm-1、1 452 cm-1處出現(xiàn)兩個拉曼峰，兩組在1 452 cm-1峰強(qiáng)之間有顯著差異(圖3、圖4)。

3 討論

人體細(xì)胞每一種生物大分子都有其對應(yīng)的拉曼峰。蛋白質(zhì)、DNA、脂類的部分原子團(tuán)結(jié)構(gòu)和鍵的位置對特定的振動頻率敏感，生物分子的拉曼光譜中含有特定的的結(jié)構(gòu)和成分信息[2]。腫瘤組織的生物大分子的結(jié)構(gòu)和成分與正常組織相比發(fā)生了顯著的變化，因此腫瘤組織的拉曼光譜有較高的特異性。同時，拉曼光譜在腫瘤血液標(biāo)志物的檢測及早期診斷方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢[3]。由于水的拉曼光譜非常弱，拉曼光譜可以在活體狀態(tài)下來研究人體大分子的結(jié)構(gòu)及其變化。已有研究表明在內(nèi)鏡下使用拉曼光譜對活體腫瘤進(jìn)行早期原位檢測具有較強(qiáng)的敏感性和特異性[4]。

圖2 腸間質(zhì)瘤和正常對照組織的拉曼光譜比較

圖3 胃腸間質(zhì)瘤低度惡性潛能組織和高度惡性潛能組織的拉曼光譜比較

圖4胃腸間質(zhì)瘤低度惡性潛能組織和高度惡性潛能組織的拉曼光譜峰強(qiáng)比較

間質(zhì)瘤組織和良性組織相比，具有細(xì)胞密度增高，細(xì)胞呈單一化。本研究結(jié)果顯示胃腸間質(zhì)瘤組織和正常對照組織的拉曼光譜存在明顯差異，腫瘤組織特征性拉曼光譜位于1 452 cm-1波數(shù)處，這說明間質(zhì)瘤組織與正常組織的明顯差異。這樣的結(jié)果需要進(jìn)一步在活體中證實(shí)。

NCCN指南及中國胃腸道間質(zhì)瘤專家共識中GIST根據(jù)部位、大小及核分裂像進(jìn)行危險度分級，來評估其惡性潛能。但是該分級方式在術(shù)前難以做到，無法對手術(shù)方式的進(jìn)行指導(dǎo)。因此建立一種無創(chuàng)的胃腸道間質(zhì)瘤術(shù)前進(jìn)行危險度分級的技術(shù)手段是非常必要的[1]。本文研究表明CD117和DOG1蛋白表達(dá)與胃腸道間質(zhì)瘤危險度分級無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而胃腸道間質(zhì)瘤低度惡性潛能組織和高度惡性潛能組織的拉曼光譜在1 452 cm-1波數(shù)處峰強(qiáng)存在顯著性差異。胃腸道間質(zhì)瘤惡性潛能除了和大小及部位有關(guān)外，最主要與細(xì)胞核分裂像的多少有關(guān)。惡性潛能高的腫瘤細(xì)胞核核分裂像增多，有絲分裂活躍，而拉曼光譜的峰值與細(xì)胞的組成成分直接相關(guān)，所以惡性潛能不同的胃腸道間質(zhì)瘤組織的拉曼光譜是存在異常的。

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