戴樹龍 馬海青 李斐 楊坤興

吉西他濱(gemcitabine, GEM)單藥化療為晚期胰腺癌的標準一線治療，但療效欠佳，耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要原因[1]。HSP90是一種分子伴侶蛋白，參與蛋白質(zhì)的聚集、折疊、裝配及轉(zhuǎn)運等過程，與胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等多種惡性腫瘤的發(fā)展都有密切的關(guān)系[2]。17-AAG是HSP90的特異性抑制劑，對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，成為治療的新靶點。本研究采用CCK-8法測定不同時間、不同濃度的17-AAG、GEM及兩者聯(lián)合用藥對人胰腺癌BxPC-3細胞株增殖的抑制作用，為中晚期胰腺癌患者提供新的聯(lián)合化療方案和理論依據(jù)。

一、材料與方法

1．細胞培養(yǎng)及分組： 人胰腺癌細胞株BxPC-3購自南京凱基生物公司，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期細胞，以3×104個/ml的密度接種于96孔板，每孔200 μl，分為空白組、對照組、17-AAG組、GEM組、聯(lián)合用藥組。空白組只加培養(yǎng)液；對照組為不加藥的BxPC-3；17-AAG組分為終濃度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml 17-AAG的各組；GEM組分為終濃度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml GEM的各組；聯(lián)合用藥組按照單藥組的濃度梯度聯(lián)合應(yīng)用17-AAG和GEM。每組設(shè)5個復(fù)孔。17-AAG購自美國SANTA公司，GEM由南京市第一醫(yī)院腫瘤科提供。

2．CCK-8法檢測細胞增殖抑制率： 上述各組細胞分別培養(yǎng)24、48 h后每孔加入5 mg/ml CCK-8液20 μg，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。上酶標儀測定各孔在波長490 nm處的吸光值(A490值)，以空白組調(diào)零。細胞增殖抑制率=(對照組A490值-實驗組A490值)/ 對照組A490值×100%。實驗重復(fù)3次，取均值。

二、結(jié)果

17-AAG組、GEM組及聯(lián)合用藥組均呈濃度及時間依賴性抑制BxPC-3細胞的增殖。與對照組相比，不同濃度的17-AAG、GEM對BxPC-3細胞作用24 、48 h后均有抑制作用(圖1、2)；隨著藥物濃度的增加，其產(chǎn)生的抑制效果越明顯(P<0.05)。作用48 h各組對BxPC-3細胞增殖的抑制率高于24 h各組；聯(lián)合用藥組24、48 h時對BxPC-3細胞增殖的最高抑制率分別為65.1%及83.2%，顯著高于單獨用藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

討論胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，85%的患者就診時已屬晚期，手術(shù)切除率僅10%～15%，5年生存率僅1%～5%[3]。GEM常用于中晚期胰腺癌的化療，但易產(chǎn)生耐藥。Derong等[4]研究表明，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)參與調(diào)節(jié)多重耐藥基因(MDR-1)和核糖核苷還原酶(RRM1)的表達改變可能與胰腺癌對GEM的抵抗有關(guān)。

圖1 24 h時各實驗組藥物對人胰腺癌BxPC-3細胞增殖的抑制率

圖2 48 h時各實驗組藥物對人胰腺癌BxPC-3細胞增殖的抑制率

HSP90在多種腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)。李亮等[5]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中HSP90的表達不僅明顯高于正常組織，且其表達還與淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)。17-AAG是HSP90的特異性拮抗劑，目前已進入了臨床應(yīng)用，在實體腫瘤及白血病的臨床治療中均有不錯的效果[6]。一方面，17-AAG通過增加抑癌基因p53的表達從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]；另一方面，17-AAG可減輕肺癌患者對放療藥的耐藥性，明顯增強其治療效果[8]。因此，17-AAG可能還可以通過調(diào)節(jié)ERK通路增強胰腺癌患者對GEM的敏感性。

本研究通過CCK-8法證實聯(lián)合應(yīng)用17-AAG與GEM對胰腺癌BxPC-3細胞增殖的抑制率明顯高于單獨用藥組，在48 h時最高可達83.2%。但目前的結(jié)果僅限于細胞水平的研究，本課題組還將進一步建立胰腺癌裸鼠動物模型來評估聯(lián)合用藥在體內(nèi)實驗中的效果及安全性，并測定與腫瘤相關(guān)的HSP90伴侶蛋白胰島素樣生長因子、表皮生長因子受體、磷脂酰激酶-3-激酶及酪氨酸激酶的表達，進一步探討17-AAG和GEM聯(lián)合用藥的抗癌機制，為胰腺癌聯(lián)合化療的可行性提供新的實驗室依據(jù)。

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[2] Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, et al. Negative regulation of cytochrome c-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90[J].EMBO J,2000,19(16):4310-4322. DOI:10.1093/emboj/19.16.4310.

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