于賢金 周亮 何亞紅 張?bào)泺P

以吉西他濱(gemcitabine，GEM) 為基礎(chǔ)的化療藥物主要用于進(jìn)展期或手術(shù)無法切除的胰腺癌的輔助治療[1-3]。但GEM不能明顯提高患者的生存期，且具有較為嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用[4-5]，因此研發(fā)一種新型的高效、低毒抗腫瘤藥物具有重要意義。細(xì)梗香草(lysimachia capilliposide hemsl)又名排草、香排草、香草、毛柄珍珠菜, 系報(bào)春花科珍珠菜屬植物。細(xì)梗香草的主要成分為皂苷(capilliposide，LC)，它有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[6-7]。相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LC對(duì)肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌均有生長抑制作用[8-10]，但尚未見其對(duì)胰腺癌的作用。本研究觀察LC對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3細(xì)胞增殖的影響，初步探究其作用機(jī)制。

材料和方法

一、細(xì)胞存活率檢測

BxPC-3細(xì)胞株由上海長海醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長期BxPC-3細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后分別加入2、4、8、16、32、64 μg/ml的LC繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h，以不加LC的細(xì)胞作為對(duì)照組，每個(gè)濃度每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。LC由浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)結(jié)束后吸棄原培養(yǎng)液，每孔加100 μl新培養(yǎng)液、20 μl MTT(美國艾美捷科技有限公司)繼續(xù)培養(yǎng)1 h，上酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm波長處的吸光值(A490值)。細(xì)胞存活率=LC組A490值/對(duì)照組A490值×100%，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞存活率曲線，確定LC的50%抑制濃度(IC50)值。

二、細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)生長期的BxPC-3細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后每孔加入IC50的LC繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用不含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，取(1～5)×105細(xì)胞用100 μl Binding Buffer重懸，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)10 min。加入400 μl Binding Buffer，混勻，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

三、細(xì)胞周期檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。取對(duì)數(shù)生長期的BxPC-3細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后加入IC50的LC繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，以預(yù)冷的75%乙醇固定過夜，PBS緩沖液洗滌2次，棄上清液。分別加入50 μl/ml PI及100 μl/ml RNAase混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

四、凋亡相關(guān)蛋白多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)和caspase-3表達(dá)檢測

取對(duì)照組及IC50的LC培養(yǎng)組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，應(yīng)用裂解液制備細(xì)胞勻漿。用BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測PARP、caspase-3蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人PARP一抗購自Abcom公司，工作濃度1∶1 000稀釋，羊抗兔caspase-3一抗購自Abcom公司，工作濃度1∶5 000稀釋，最后應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。IPP6.0軟件進(jìn)行條帶掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞存活率的影響

8～32 μg/ml LC呈濃度依賴性抑制BxPC-3的存活，但培養(yǎng)48 h與72 h的細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。LC干預(yù)48、72 h后BxPC-3細(xì)胞IC50的LC濃度分別為(15.84±0.7)μg/ml、(15.17±0.76)μg/ml，故選取15 μg/ml的LC進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖1 LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞存活率影響的生長曲線

二、LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組與15 μg/ml LC干預(yù)48 h組BxPC-3凋亡率分別為(1.5±0.22)%、(17.3±0.31)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-71.992,P<0.05，圖2)。

圖2 LC對(duì)兩組BxPC-3細(xì)胞凋亡的影響

三、LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞周期的影響

對(duì)照組與15 μg/ml LC干預(yù)24 h組BxPC-3處于G0/G1的比例分別為(44.95±2.59)%、(38.84±2.75)%；G2/M的比例分別為(6.42±1.30)%、(10.78±1.48)%；S期的比例分別為(43.63±3.84)%、(50.38±4.11)%(圖3)，兩組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 LC對(duì)兩組BxPC-3細(xì)胞周期的影響

四、LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞PARP和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、15 μg/ml LC干預(yù)48 h組的PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1593.4±29.7、36.1±4.8；caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為149.1±10.2、2207.2±92.0(圖4)。LC組的PARP表達(dá)顯著下降，而caspase-3表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為89.533、-38.505，P值均<0.05)。

圖4 LC對(duì)兩組BxPC-3細(xì)胞PARP和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

討 論

我國傳統(tǒng)中醫(yī)在腫瘤的治療方面已取得了不少突破。中藥可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合中醫(yī)藥治療可減輕腫瘤患者癥狀，明顯提高生活質(zhì)量，延長生存期[11]。此外，中藥與化療伍用還具有較為顯著的增效減毒、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等作用。細(xì)梗香草皂苷已在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能抑制人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞惡性表型，并誘導(dǎo)其凋亡；可通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)，激活線粒體凋亡途徑，抑制肺癌細(xì)胞H460；能顯著抑制前列腺癌、胃癌細(xì)胞增殖，其抗腫瘤作用可能與增強(qiáng)免疫功能和抑制腫瘤血管新生有關(guān)；還能通過抑制蛋白激酶活性，降低人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性[8-10,12]。

細(xì)胞凋亡是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下,通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡，可維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。其中caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的執(zhí)行者，能特異性識(shí)別、分解PARP，阻止其修復(fù)細(xì)胞受損DNA；還能裂解核纖層蛋白、凝溶膠蛋白和激動(dòng)蛋白等，破壞細(xì)胞完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示LC對(duì)BxPC-3細(xì)胞呈濃度依賴性顯著抑制細(xì)胞的存活率，LC干預(yù)BxPC-3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡顯著增加，caspase-3表達(dá)上調(diào)，PARP蛋白表達(dá)下調(diào)，提示LC抑制BxPC-3生長的作用機(jī)制可能是通過激活caspase-3，分解PARP，抑制受損細(xì)胞的基因修復(fù)，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。

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