張文婷，江 蓮，朱秀麗，劉翠萍，陳 健

強(qiáng)心甾是一類具有強(qiáng)心作用的甾體化合物，臨床上用于治療心力衰竭和心律失常。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心甾類藥物可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，且不影響正常細(xì)胞的功能。因此，有學(xué)者認(rèn)為強(qiáng)心甾是一類新型的腫瘤靶向藥物[1]。地高辛是一種臨床上常用的強(qiáng)心甾類藥物，目前少見有關(guān)地高辛對(duì)惡性淋巴瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制的研究報(bào)道。本研究通過體外培養(yǎng)人B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞，觀察強(qiáng)心甾類藥物地高辛對(duì)其增殖和凋亡的影響，并檢測(cè)Survivin、Caspase-3在細(xì)胞中的表達(dá)情況，初步探討地高辛對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的作用及其可能的分子機(jī)制，為地高辛抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步探討新型抗腫瘤藥物提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

1.1.2 主要試劑 地高辛(純度≥98%)(美國(guó)AL公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、Trizol試劑盒(美國(guó)Gibco公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)、100 bp DNA Ladder(北京索來寶生物制品有限公司)，PCR引物(上海捷瑞生物有限公司)，RT-PCR二步法試劑盒、PCR用綠色體系(美國(guó)Promega公司)，瓊脂糖、溴化乙錠、乙二胺(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELDON公司)，超凈工作臺(tái)(美國(guó)BIOLOGIC公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(河北省先進(jìn)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)PE公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將Raji細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的滅活胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO溶解的地高辛，終濃度分別為25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L；對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的DMSO。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Raji細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×105/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L的地高辛進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組加入含終濃度為0.1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL。分別培養(yǎng)24、48及72 h后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.2.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和周期分布 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Raji細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×106/mL，實(shí)驗(yàn)組分別加入50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L地高辛，對(duì)照組加入0.1%DMSO。培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，取1×106/mL樣品0.1 mL，加入碘化丙啶染液1 mL，在4 ℃冰箱避光染色30 min后上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，用流式細(xì)胞分析軟件分析凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡百分率(apoptotic percentage,AP)，并用Muticycle AV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析。

1.2.4 檢測(cè)Raji細(xì)胞中Survivin、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)分組同上，不同濃度地高辛與Raji細(xì)胞作用48 h，細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Survivin引物：上游5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′，下游5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為447 bp；Cas-pase-3引物：上游5′-GGTGTTGATGATGACATGGCG-3′；下游5′-GTACCCTCTGCAGCATGAGAGTAG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為417 bp；β-actin引物：上游5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為312 bp。

配置含0.5 μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳，在凝膠圖像分析儀分析。測(cè)定各電泳條帶的灰度值(A)，用β-actin的A值作為內(nèi)參，表達(dá)強(qiáng)度以Survivin A值/β-actin A值、Caspase-3 A值/β-actin A值的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 地高辛對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響 25 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,200 nmol/L地高辛作用于Raji細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，與對(duì)照組相比，增殖活性均有不同程度的下降。除25 nmol/L地高辛作用Raji細(xì)胞24 h后與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著時(shí)間的增加，增殖抑制率呈遞增趨勢(shì)。表明地高辛在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)Raji細(xì)胞有不同程度的增殖抑制作用，此作用呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系(表1，圖1)。

表1 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞 24、48、72 h后吸光度值變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與25 nmol/L比較，△P<0.05；與50 nmol/L比較，◆P<0.05；與100 nmol/L比較，☆P<0.05

圖1 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞 24 h、48 h、72 h后增殖抑制率變化

2.2 地高辛對(duì)Raji細(xì)胞周期的影響 50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期分布均發(fā)生變化，G0/G1期和S期細(xì)胞數(shù)減少，G2/M期細(xì)胞數(shù)增加。實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.030，P<0.05)。由此說明地高辛可阻滯Raji細(xì)胞于G2/M期，隨著地高辛濃度的增加，阻滯作用增強(qiáng)，呈一定劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系(表2)。

表2 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后 細(xì)胞周期的變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與50 nmol/L比較，△P<0.05；與100 nmol/L比較，◆P<0.05

2.3 地高辛對(duì)Raji細(xì)胞凋亡的影響 50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，而對(duì)照組未見凋亡峰或僅有低平的凋亡峰。經(jīng)單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組地高辛作用Raji細(xì)胞48 h后的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.409，P<0.05)，說明隨著地高辛濃度增加，引起Raji細(xì)胞凋亡率逐漸增大，即凋亡細(xì)胞數(shù)與地高辛濃度呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系(表3)。

表3 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后 細(xì)胞凋亡率的變化

2.4 地高辛對(duì)Raji細(xì)胞Survivin、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后，Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(F=504.383,P<0.05)，并隨作用濃度增加相對(duì)表達(dá)量降低，同時(shí)Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(F=391.506,P<0.05)，并隨作用濃度增加相對(duì)表達(dá)量增高(表4，圖2，圖3)。

表4 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后 Survivin、Caspase-3 mRNA表達(dá)的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與50 nmol/L比較，△P<0.05；與100 nmol/L比較，◆P<0.05

圖2 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后 Survivin mRNA和β-actin mRNA的表達(dá)

圖3 不同濃度地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后 Caspase-3 mRNA和β-actin mRNA的表達(dá)

3 討論

淋巴瘤為兒童常見惡性腫瘤之一，據(jù)流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)每年新發(fā)的兒童淋巴瘤病例為6 000～8 000例，其中80%左右為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)[2]。雖然隨著化療方案的調(diào)整和改進(jìn)，NHL的緩解率有了較高提升，但原發(fā)耐藥和反復(fù)復(fù)發(fā)仍是影響治療效果的因素之一。傳統(tǒng)化療藥物造價(jià)昂貴，兒童對(duì)化療耐受性較成年患者差，常易出現(xiàn)嚴(yán)重骨髓抑制、合并重癥感染等，限制了用藥強(qiáng)度。因此探索高效低毒的治療藥物，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心甾類藥物除了強(qiáng)心等作用外，還可以有效地殺傷人胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞[3-7]，能選擇性地抑制相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)其凋亡。研究者們推測(cè)強(qiáng)心甾類物質(zhì)極有希望成為新的抗腫瘤藥物，提出其可以單藥治療、聯(lián)合化療藥物輔助并可增強(qiáng)放療敏感性，用于腫瘤的治療[8-9]，因此越來越受到人們的關(guān)注。

地高辛是一種臨床上常用的口服劑型的強(qiáng)心甾類藥物，來源于玄參科植物洋地黃，服用方便，起效速度快，作用時(shí)間較短，濃度易于測(cè)定，應(yīng)用最為廣泛。早期地高辛被認(rèn)為具有抗腫瘤作用是因?yàn)镾tenkvist等[10]發(fā)現(xiàn)，服用地高辛的乳腺癌患者復(fù)發(fā)率及死亡率均較未口服者低。近年來，有研究對(duì)47 884例患者20年(1986～2006年)的追訪重新評(píng)估了地高辛與前列腺癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)定期服用地高辛的患者，特別是服用時(shí)間超過10年以上的患者，患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低。地高辛在體外可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，它的使用使患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低25%[11]。Pereira等[12]發(fā)現(xiàn)地高辛與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，能起到協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制，減少順鉑化療的毒性反應(yīng)。地高辛抗腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制Na+/K+-ATPase活性、激活Ras和MAPK途徑引起線粒體損傷，或通過抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄而減少蛋白質(zhì)合成等多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[6，13]。

腫瘤是一類細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制遭到破壞的疾病，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期的分布密切相關(guān)。G2/M期是細(xì)胞周期的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)，是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵[14]。本研究結(jié)果顯示，地高辛能夠明顯減少G0/G1和S期的Raji細(xì)胞，增加G2/M期細(xì)胞數(shù)。推測(cè)地高辛的作用機(jī)制可能是將細(xì)胞抑制在G2/M期的限制點(diǎn)內(nèi)從而使細(xì)胞的增殖受到抑制。同時(shí)，地高辛對(duì)Raji細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。地高辛作用于Raji細(xì)胞48 h后出現(xiàn)凋亡峰，且呈濃度依賴關(guān)系。

Survivin是迄今為止凋亡抑制蛋白家族中所發(fā)現(xiàn)的分子量最小、作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子。它在多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織及癌旁組織中無表達(dá)或低表達(dá)[15]，與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ambrosini等[16]首次報(bào)道了Survivin與NHL之間的關(guān)系，提示Survivin在NHL中高表達(dá)。有研究表明Survivin的表達(dá)與NHL的惡性程度呈正相關(guān)，常預(yù)示著較差的預(yù)后[17]。Adida等[18]用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了222例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中Survivin的表達(dá)，其陽性率為60%，且Survivin表達(dá)陽性者，5年生存率明顯低于Survivin陰性者。鑒于Survivin具有獨(dú)特的組織分布特點(diǎn)，使其在腫瘤治療時(shí)可發(fā)揮不傷及正常組織的特性，所以Survivin有可能會(huì)成為較理想的抗腫瘤潛在靶點(diǎn)[19]。Survivin可通過調(diào)節(jié)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7，抑制各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20-21]。Survivin最終通過抑制終末效應(yīng)蛋白Caspase-3來抑制細(xì)胞的凋亡。Caspase-3是Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者，活化的Caspase-3通過特異性地裂解一系列底物而直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，Survivin mRNA含量明顯降低，Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高，表明地高辛可以通過下調(diào)Survivin，激活Caspase-3的表達(dá)來促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，強(qiáng)心甾類藥物地高辛對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其可能涉及的機(jī)制包括使Raji細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞增殖；通過下調(diào)Survivin的表達(dá)、活化Caspase-3來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)強(qiáng)心甾類藥物抗淋巴瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為強(qiáng)心甾類藥物應(yīng)用于淋巴瘤治療提供了新的思路。但其在體內(nèi)的作用有待于進(jìn)一步研究，且地高辛過量會(huì)引起心臟毒性。目前，研究人員已在探索合適的地高辛抗腫瘤治療劑量，希望其既能發(fā)揮抗腫瘤作用，又不增加毒性反應(yīng)[22]。將地高辛與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有可能成為今后淋巴瘤治療中的一種更好選擇。

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