陳 超，張延慧，王明卉，許 勝，劉翠云,李培峰，王 昆

阿霉素(doxorubicin,DOX)是屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素。作為化療藥物廣泛用于治療各種腫瘤，臨床上多用于治療乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、白血病等多種惡性腫瘤[1]。然而，限制其臨床應(yīng)用的主要因素是化學(xué)治療中發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)帶來的心臟毒性，其劑量的增加和積累會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的且不可逆的各種擴(kuò)張性心肌病以及充血性心力衰竭。雖然一些研究表明DOX是心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵刺激因素，但迄今為止，未能找到有效治療DOX誘發(fā)的心臟毒性和心力衰竭的方法[2]。因此，研究和了解這一過程所依賴的分子機(jī)制是非常重要的，揭示DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制將為降低心臟毒性和保護(hù)心臟功能提供新的途徑。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200 bp且缺乏蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在基因組印記、X染色體沉默以及核內(nèi)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、染色質(zhì)修飾等多種重要的調(diào)控過程中扮演重要角色[3]。近年來的研究證實(shí)lncRNA可能作為治療的潛在靶點(diǎn)在心臟再生和修復(fù)中起重要作用[4]。本研究采用lncRNAs基因芯片篩選表達(dá)差異明顯的lncRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。

線粒體對(duì)細(xì)胞的生命和死亡起著重要的作用[5]。線粒體的融合和裂變已被確定為DOX誘導(dǎo)心臟細(xì)胞損傷的主要因素之一[6]。51 kDa的線粒體動(dòng)力學(xué)蛋白、MIEF1基因在調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)中起重要作用。據(jù)報(bào)道，敲除MIEF1可降低Drp1的結(jié)合并增強(qiáng)線粒體融合[7]，另有報(bào)道也發(fā)現(xiàn)MIEF1起到增強(qiáng)線粒體融合作用[8]。然而，目前尚不清楚MIEF1是否參與了DOX治療對(duì)心肌細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 C57BL/6J小鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[SCXK-(魯)-2014-0007]；昆明小鼠乳鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[SCXK-(魯)-2014-0007]；鹽酸阿霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；MIEF1抗體(英國Gibico公司)；內(nèi)參β-actin抗體(武漢博士德公司)；二抗山羊抗兔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；山羊抗小鼠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，商品編號(hào)：ZF-0312)；RR820A takara SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa公司)；DMEM培養(yǎng)基(英國Gibico公司)；胎牛血清(英國Gibico公司)；胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(日本TaKaRa公司)；TRIzol試劑盒(日本TaKaRa公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；放射免疫沉淀法裂解液(北京索萊寶公司)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(德國Milli-pore公司)，western-抗二抗去除液(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 根據(jù)篩選出的差異表達(dá)lncRNAs基因，對(duì)研究中上調(diào)最為明顯的lncRNA，NONMMUT071802，我們命名為心肌細(xì)胞凋亡因子(cardiac apoptosis factor，CAF)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。分別檢測(cè)正常對(duì)照組和DOX處理組總RNA中l(wèi)ncRNA CAF含量。具體實(shí)驗(yàn)方法：采用合適方法提取細(xì)胞總RNA，將提取好的總RNA從-80℃冰箱取出，對(duì)總RNA使用miRcute mi-RNA First-Strandc DNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。然后對(duì)已經(jīng)合成的cDNA使用RR820A takara SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR System qPCR反應(yīng)檢測(cè)。最后使用ABI7900熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 載體的構(gòu)建 使用PCR擴(kuò)增lncRNA CAF全長，將擴(kuò)增后的lncRNA CAF全長雙酶切連接至pcDNA3.1(-)載體的EcoRI和XhoI之間，構(gòu)建過表達(dá)pcDNA3.1(-)-CAF；按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則結(jié)合慢病毒載體質(zhì)粒pLKO.1-puro結(jié)構(gòu)的特征設(shè)計(jì)合成shRNA序列，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建lncRNA CAF的RNA干擾慢病毒載體pLKO.1-CAF-shRNA，酶切位點(diǎn)為AgeI和EcoRI。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后，挑取陽性克隆子進(jìn)行質(zhì)粒抽提電泳及測(cè)序鑒定。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立慢性DOX心臟毒性模型[9-10]，具體如下:將12只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成2組:實(shí)驗(yàn)組6只，腹腔注射DOX 5 mg/kg，1周1次，連續(xù)注射4周；同時(shí)設(shè)立等劑量生理鹽水注射對(duì)照組6只，同一時(shí)間每周注射。4周后行心臟超聲檢測(cè)，評(píng)估小鼠心功能狀態(tài)；同時(shí)處死小鼠，取出左心室心肌標(biāo)本。取小鼠心肌組織于-80 ℃中保存，用于后續(xù)基于MIEF1的基因和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.4.2 細(xì)胞分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)，共分為pcDNA3.1(-)空載對(duì)照組、pcDNA3.1(-)-CAF組、pLKO.1空載對(duì)照組和pLKO.1-CAF-shRNA(CAF-siRNA)組。

1.5 超聲心動(dòng)觀察 用4%水合氯醛以0.1 mL/10g劑量腹腔注射麻醉，脫毛后將小鼠仰臥位固定于加溫的檢查臺(tái)，連接心電圖電極。

1.6 小鼠體重和心室質(zhì)量稱重 每次注射藥物注射后稱量體重(body weight，BW)，取第一周稱重和第四周稱重分別為初重和終重。處死小鼠后，立即取出心臟，置于冷生理鹽水中洗去血液，濾紙吸干水分，測(cè)心室質(zhì)量(ventricular weight，VW)，并計(jì)算VW/BW的比值。

1.7 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 用75%酒精浸泡1～3 d齡昆明小鼠乳鼠，消毒2次，無菌操作下取出心臟，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗2遍。于滅菌超凈臺(tái)中用眼科剪取心尖大部放入盛有1×ADS buffer的小平皿中，并放在冰臺(tái)上清洗3次后剪刀剪碎并用混合酶液(膠原酶：10 mg/mL，胰液素：30 mg/mL)消化，所提取的細(xì)胞置于含有5%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，種于6孔板，細(xì)胞濃度調(diào)到(0.5～1)×105/mL。差速貼壁2 h后更換新的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將6孔板中生長狀態(tài)良好的乳鼠心肌細(xì)胞用Lipofectamine2000將pcDNA3.1(-)空載、pcDNA3.1(-)-CAF、pLKO.1空載和pLKO.1-CAF-shRNA(CAF-siRNA)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。分別為pcDNA3.1(-)空載對(duì)照組、pcDNA3.1(-)-CAF組以及pLKO.1空載對(duì)照組和pLKO.1-CAF-shRNA(CAF-siRNA)組。置37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，24 h后提取細(xì)胞產(chǎn)物。

1.9 qRT-PCR檢測(cè)MIEF1基因的表達(dá) 組織樣本:取100 mg心肌組織樣本加1 mL TRIzol試劑冰上研磨裂解細(xì)胞；細(xì)胞樣本:細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后用TRIzol試劑裂解細(xì)胞(6孔板每孔加1 mL TRIzol試劑)。細(xì)胞裂解后用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用ABI StepOne實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min、95 ℃10 s、60 ℃ 30 s共34個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.10 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 組織樣本：每組取3只小鼠心室標(biāo)本以100 ug/mL TRIzol分別行組織勻漿，組織裂解液裂解，提取上清液，BCA法行總蛋白定量，測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(40 μg/孔)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉 1 h后加入MIEF1的兔 -多克隆抗體(1∶1 000)，室溫孵育2 h后用TBST緩沖液(NaCl 8.5 g/L、Tris 6.05 g/L、Tween20 1 mL/L，pH=7.45)洗膜,HRP-山羊抗兔IgG 的二抗 (1 ∶2 000)孵育1.5 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，X線顯影。掃描并保存圖像后，用western一抗二抗去除液清洗PVDF膜后重新進(jìn)行封閉，加入β-actin的小鼠多克隆抗體(1：2 000)及HRP-山羊抗小鼠IgG 的二抗 (1 ∶2 000)孵育，顯影后保存影像并以β-actin表達(dá)作內(nèi)參分析結(jié)果。

細(xì)胞樣本：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，后續(xù)操作同組織樣本中總蛋白的提取。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重與心臟重量的變化 正常對(duì)照組BW明顯增加，而實(shí)驗(yàn)組BW明顯降低，2者有顯著差異(P<0.05)，2組VW相比無顯著差異，而實(shí)驗(yàn)組VW/BW明顯增加，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(n=6;P<0.05，表2)。

表2 注射藥物4周后2組BW、VW及VW/BW

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 小鼠心臟功能檢測(cè) DOX處理組(圖1B)小鼠心臟超聲心動(dòng)波形圖與對(duì)照組(圖1A)相比，振幅降低，頻率略有減少，心室容積下降，其心功能下降明顯。

圖1 小鼠超聲心動(dòng)圖

2.3 差異表達(dá)明顯的lncRNA CAF行RT-PCR驗(yàn)證 2 μmol/L DOX處理24 h后，DOX組lncRNA CAF的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01,圖2)。

注：與對(duì)照組比較，n=4;*P<0.01圖2 2 μmol/L DOX處理的心肌細(xì)胞中 lncRNA CAF的表達(dá)量

2.4 DOX對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)MIEF1的抑制作用

2.4.1 心臟毒性模型中各組MIEF1的表達(dá)水平經(jīng)5 mg/kg濃度DOX體外注射4周后，每組取3只小鼠的心室標(biāo)本做MIEF1實(shí)驗(yàn)的基因表達(dá)量檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示DOX誘導(dǎo)的心臟毒性模型組中MIEF1在基因水平上的表達(dá)量低于對(duì)照組(n=3；t=14.978，因P<0.01，圖3)。每組取4只小鼠的心室標(biāo)本做MIEF1的蛋白水平表達(dá)量檢測(cè)。蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示DOX處理組中基因MIEF1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)量都低于對(duì)照組(n=4;t=8.47，P<0.01，圖4)。

注：與對(duì)照組比較，n=3;*P<0.01圖3 DOX心臟毒性模型中MIEF1的基因表達(dá)量變化

圖4 DOX心臟毒性模型中MIEF1的蛋白表達(dá)量變化

2.4.2 小鼠原代心肌細(xì)胞中的各組MIEF1的表達(dá)水平 2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L DOX處理24 h后，小鼠原代心肌細(xì)胞每組中基因MIEF1在基因水平上的表達(dá)量都低于對(duì)照組，并且其表達(dá)量呈明顯的梯度遞減(n=4；t2 μmol/L=33.423,P<0.01；t4 μmol/L=36.120,P<0.01；t6 μmol/L=40.205,P<0.01，圖5)，蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠原代心肌細(xì)胞中2 μmol/L DOX處理組中基因MIEF1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)量都低于對(duì)照組(n=4，P<0.05，圖6)。

注：2 μmol/L DOX組與對(duì)照組比較，n=4;*P<0.01； 4 μmol/L DOX組與對(duì)照組比較，n=4;**P<0.01； 6 μmol/L DOX組與對(duì)照組比較，n=4;***P<0.01圖5 不同濃度的DOX對(duì)小鼠原代心肌細(xì)胞表達(dá)量的變化

圖6 2 μmol/L DOX處理的乳鼠心肌細(xì)胞中MIEF1 的蛋白表達(dá)量變化

2.5 小鼠原代心肌細(xì)胞中CAF對(duì)MIEF1基因表達(dá)水平的影響 pcDNA3.1(-)-CAF過表達(dá)組MIEF1的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(n=4；t=12.909,P<0.01)；si-lncRNA組細(xì)胞的MIEF1表達(dá)水平明顯高于NC組(n=4；t=33.634,P<0.01，圖7)。

注：與對(duì)照組比較，n=4;*P<0.01；n=4;**P<0.01圖7 乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MIEF1的mRNA水平相對(duì)表達(dá)

2.6 小鼠原代心肌細(xì)胞中CAF對(duì)MIEF1蛋白表達(dá)水平的影響 2 μmol/L DOX處理24 h后，pcDNA3.1(-)-lncRNA過表達(dá)組MIEF1的表達(dá)明顯低于NC組(P<0.05)，si-lncRNA組中MIEF1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05，圖8)。

注：與對(duì)照組比較，n=4;*P<0.01；n=4;**P<0.01圖8 MIEF1在各組中的表達(dá)

3 討論

DOX是一種用于癌癥化療的有效藥物，然而，DOX的使用受到其副作用的極大限制。DOX在許多方面對(duì)細(xì)胞的存活是惡性的，包括誘導(dǎo)DNA損傷、增加活性氧生成和線粒體過激活[1,11]。心臟似乎是最易感的組織[12]，DOX誘導(dǎo)的心臟毒性通常在臨床實(shí)踐中構(gòu)成挑戰(zhàn)。探索和揭示DOX心臟毒性的潛在機(jī)制可能在癌癥治療中具有突破性的發(fā)現(xiàn)，然而，DOX心臟毒性的確切機(jī)制仍然在很大程度上是未知的。許多研究表明凋亡在確定心肌細(xì)胞的命運(yùn)方面起重要作用[13]。據(jù)報(bào)道，DOX已被證明能激活胱天蛋白酶并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[14-15]。DOX還可以增加氧化劑產(chǎn)生并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心肌病[16]。DOX也可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞中caspase依賴性凋亡[17]。DOX誘導(dǎo)的心臟損傷與心臟氧化應(yīng)激增加密切相關(guān)，抗氧化劑水平降低[18]。

線粒體是不斷進(jìn)行裂變和融合并在心肌細(xì)胞中形成動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)的移動(dòng)細(xì)胞器[19]，線粒體融合產(chǎn)生長線粒體小管，而裂變導(dǎo)致小圓囊泡[20]，線粒體的功能障礙與心臟毒性有關(guān)，已被確定為DOX誘導(dǎo)心臟亞細(xì)胞損傷的主要靶點(diǎn)之一[6]，線粒體形態(tài)動(dòng)態(tài)可影響細(xì)胞凋亡[21]。因此，保持線粒體完整性對(duì)于維持能量產(chǎn)生和防止細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。線粒體不斷經(jīng)歷融合和裂變，這是維持細(xì)胞器保真所必需的[22]。線粒體裂隙的抑制增強(qiáng)心肌細(xì)胞的功能[23]，線粒體裂變受線粒體裂變蛋白激酶相關(guān)蛋白1(Drp1)調(diào)控[24]，在線粒體裂變過程中，Drp1聚合并在收縮位點(diǎn)環(huán)化[25]，而抑制Drp1可減輕心肌細(xì)胞線粒體裂隙[26]。MIEF1和MIEF2都是線粒體外膜蛋白[27]，研究發(fā)現(xiàn)，敲除MIEF2抑制DOX誘導(dǎo)的線粒體分裂，抑制原代心肌細(xì)胞的凋亡以及小鼠的心臟毒性，揭示了由Foxo3a和MIEF2組成的調(diào)節(jié)DOX心臟毒性的新途徑[28]。

lnc-RNA在心臟發(fā)育和功能維持中具有重要作用。越來越多的研究表明lnc-RNA在冠心病[29]、先天性心臟病[30]、心肌疾病[31]、心肌肥厚、心肌纖維化以及心力衰竭等方面中發(fā)揮著重要作用。目前為止，lnc-RNA在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性上的研究在很大程度上仍然是未知的，值得我們研究。

本研究首次證明lncRNA CAF介導(dǎo)的MIEF1參與DOX心臟毒性的調(diào)節(jié)，研究結(jié)果將為DOX心臟毒性分子機(jī)制的研究提供新的見解。本研究揭示了MIEF1和lncRNA CAF在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中的作用，而lncRNA CAF和MIEF1將是有希望的治療靶點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)為治療心臟保護(hù)提供了治療策略。

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