王秀娟，薛玉英,* ,唐萌

1. 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009 2. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院&蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210009 3. 江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

納米材料是指在三維尺度上至少有一維尺度小于100 nm的物質(zhì)[1]。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的納米材料開始應(yīng)用于食品、藥品、電子、包裝、化工等領(lǐng)域。納米產(chǎn)品層出不窮，給人們的生活帶來了極大的便利，與此同時(shí)，納米物質(zhì)與人體接觸的機(jī)會也隨之增加，其安全性問題逐漸引起廣泛關(guān)注。

納米銀是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制而成的新型納米材料，具有比表面積大、尺寸小、強(qiáng)表面活性、強(qiáng)催化性能等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、陶瓷、光學(xué)、紡織、化妝品、催化劑、半導(dǎo)體材料、低溫導(dǎo)熱材料、水質(zhì)凈化等方面[2]。銀有很長的應(yīng)用歷史，在古代用銀做器皿、頭飾，含銀的敷料用于治療燒燙傷，此外，銀還能夠用于外科手術(shù)，銀的這些廣泛應(yīng)用主要利用其優(yōu)良的抗菌特性。與普通銀相比，納米銀的抗菌特性更強(qiáng)，因而應(yīng)用范圍更加廣泛。當(dāng)今社會，由于抗生素的濫用使動物產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，納米銀常被添加到飼料中來代替抗生素[3]；納米銀凝膠制劑可用于治療宮頸炎、宮頸糜爛等婦科疾??；一些空氣清新劑中加入納米銀以提高使用效果。越來越多的含納米銀產(chǎn)品走進(jìn)人們的日常生活中，使人體在不知不覺中接觸到納米銀，然而，人們對于納米銀的毒作用、其毒作用的影響因素、作用機(jī)制的了解卻少之又少。因此，本文結(jié)合以往的研究對以上問題進(jìn)行闡述，以求增強(qiáng)人們對納米銀的認(rèn)識，希望可以為納米銀的應(yīng)用帶來更多的啟示和警醒。

1　納米銀的暴露及體內(nèi)分布(Exposure and biodistribution of silver nanoparticles)

人類接觸納米銀的途徑有很多，其中最常見的接觸方式有呼吸系統(tǒng)接觸、消化道接觸、以及皮膚接觸，暴露途徑不同，使其在機(jī)體內(nèi)的分布情況不同，對人體健康的影響也有所差異。大量研究表明，機(jī)體經(jīng)呼吸道暴露于納米銀后，納米銀主要蓄積在肺部，并對肺造成一定的不良影響。Davenport等[4]用納米銀對小鼠進(jìn)行吸入染毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米銀主要集中在肝、腦及腸道相關(guān)淋巴組織中，該試驗(yàn)表明雖然呼吸道暴露后肺通常是主要靶器官，但是由于納米粒子極小很容易被轉(zhuǎn)運(yùn)到其他組織或器官中。納米銀經(jīng)口進(jìn)入機(jī)體是最為常見的一種暴露途徑，經(jīng)口暴露的納米銀主要分布于胃腸道、肝臟、腎臟和脾臟；除此之外，有研究證明經(jīng)口暴露的納米銀還可通過血腦屏障到達(dá)大腦，并在腦中蓄積[5]。皮膚作為人體最大的防御器官，當(dāng)皮膚破損或機(jī)體抵抗能力下降時(shí)，外來物質(zhì)可穿透皮膚進(jìn)入機(jī)體。有研究表明，納米銀具有穿透完整皮膚的能力，分布于表皮和真皮層[6]。此外，真皮中的納米銀還可以通過皮下淋巴系統(tǒng)到達(dá)全身。Tang等[7]對大鼠皮下注射50～100 nm的納米銀，發(fā)現(xiàn)納米銀顆?？蛇M(jìn)入血液循環(huán)，主要分布到腎臟、肝臟、脾臟、大腦和肺中。任何一種物質(zhì)的毒性都源于它的生物可滲透性，納米銀亦是如此；作為一種應(yīng)用十分廣泛的納米材料，納米銀在給人類創(chuàng)造價(jià)值的同時(shí)，其廣泛的暴露途徑也增加了對人類健康的危害。

2　納米銀的體內(nèi)毒性(The interal toxicity of silver nanoparticles)

為了研究納米銀的體內(nèi)毒性，常采用灌胃、吸入、氣管滴注、皮下注射或靜脈注射等方式進(jìn)行動物試驗(yàn)。表1簡單歸納了納米銀對各個系統(tǒng)的毒性研究。

2.1　對消化系統(tǒng)的毒性

納米銀以其獨(dú)特的抗菌特性被廣泛應(yīng)用于各種日常用品和包裝材料中。作為食品添加劑，它可以防止果汁結(jié)塊而保持澄清；納米銀包裝材料與普通包裝材料相比具有更好的機(jī)械性能、熱力學(xué)性能、阻隔性能以及抗菌性能。食物中的納米銀可以被消化道攝入，包裝材料中的納米銀也可以緩慢地釋放到食物中進(jìn)而被人體吸收，消費(fèi)者很可能在毫無察覺的情況下接觸到納米銀，因此建立納米銀對于人體的健康危險(xiǎn)度評價(jià)顯得尤為重要。

普遍認(rèn)為，納米銀的吸收速率隨著粒徑的減小而增大[8]。經(jīng)呼吸道吸入的納米顆粒也可以通過粘液纖毛運(yùn)動再吞咽至胃腸道內(nèi)[9]。Walczak等[10]用60 nm的納米銀和銀離子(硝酸銀)利用人體消化道的體外模型進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示經(jīng)過唾液和胃的消化，納米銀數(shù)量顯著下降，經(jīng)腸道消化后又回到原始值。起初納米銀顆粒的減少由其聚集造成，這些聚集體由納米銀和氯元素組成，而在腸消化過程中，這些聚集體又重新解體回到游離的納米銀顆粒狀態(tài)，因此納米銀可以在其原始濃度上到達(dá)腸壁。一旦被腸粘膜吸收，納米銀靶向到達(dá)肝。Ebabe Elle等[11]在一個81 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，納米銀(20 nm)可引起大鼠肝中低密度脂蛋白、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6水平增加，血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性增加，對氧磷酶活性下降，肝發(fā)生炎癥，肝功能異常。Kim等[12]在對F344大鼠經(jīng)口喂養(yǎng)納米銀(56 nm)的90 d研究中發(fā)現(xiàn)，納米銀可導(dǎo)致大鼠膽管增生，肝小葉的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，淋巴中的B細(xì)胞和IgE含量增加。由此，可證明納米銀具有肝毒性。Qin等[13]用PVP包被的納米銀和硝酸銀(Ag+)以0.5 mg·kg-1和1.0 mg·kg-1的劑量對100只雄鼠和雌鼠口服喂養(yǎng)28 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AgNPs組和AgNO3組在動物體重、器官重量、攝食量以及組織病理學(xué)檢查中均無明顯差異，肝和腎為主要靶器官，其次為睪丸和脾，器官中的Ag含量檢測發(fā)現(xiàn)AgNPs組低于AgNO3組，血生化指標(biāo)明顯異常。該試驗(yàn)表明無論是納米銀還是Ag+均會對機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。

2.2　對呼吸系統(tǒng)的毒性

由于納米銀粒徑極小,因此很容易通過簡單擴(kuò)散的形式經(jīng)過肺泡進(jìn)入體內(nèi)，一般而言，粒徑越小進(jìn)入呼吸道的部位越深。納米銀進(jìn)入體內(nèi)后，其轉(zhuǎn)移途徑主要有5種：經(jīng)呼氣再次排出體外、穿過肺泡進(jìn)入血液循環(huán)、遷移至淋巴循環(huán)、被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬、沉積在肺泡上皮細(xì)胞中。肺組織中沉積的納米銀,可引發(fā)肺部炎癥。在一個亞慢性納米銀吸入毒性研究中，Sung等[14]給8周大的Sprague-Dawley大鼠(雌雄各半)吸入性染毒粒徑為18～19 nm的納米銀90 d后，結(jié)果顯示雌鼠和雄鼠體內(nèi)均出現(xiàn)劑量依賴性的膽管增生，肺功能下降，肺組織有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚以及小的肉芽腫樣病變。Hyun等[15]用13～15 nm的納米銀對6周大的Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行重復(fù)鼻粘膜染毒，28 d后發(fā)現(xiàn)與對照組和低劑量組相比高劑量組中含黏液素的杯狀細(xì)胞體積和數(shù)量顯著增加，黏液素中硫黏蛋白含量輕微上升，而唾液粘蛋白未出現(xiàn)顯著變化，該試驗(yàn)盡管觀察到了納米銀對黏膜黏液素的影響，但不足以說明納米銀具有毒性效應(yīng)；鑒于黏液素在呼吸系統(tǒng)健康和宿主抵抗力中的重要作用，因此需要更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。Silva等[16]用20 nm和110 nm的納米銀對大鼠進(jìn)行霧化吸入染毒，并分別在第1、7、21、56天檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織，結(jié)果顯示BALF中細(xì)胞總數(shù)、蛋白質(zhì)、乳酸脫氫酶含量在第7天顯著增加，并伴隨顯著的細(xì)胞毒性反應(yīng)，組織病理學(xué)檢查顯示肺部發(fā)生炎癥，并達(dá)到峰值；第21天檢測到20 nm納米銀組多形核細(xì)胞數(shù)量多于110 nm納米銀組，組織炎癥較110 nm納米銀組嚴(yán)重；第56天炎癥反應(yīng)消失。該研究表明，吸入染毒納米銀可導(dǎo)致肺部發(fā)生遲緩性、短暫性的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性，且粒徑較小的納米銀引起的毒性反應(yīng)更加強(qiáng)烈。

2.3　對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性

許多研究證實(shí)沉積在鼻粘膜上的納米顆?？赏ㄟ^嗅覺神經(jīng)到達(dá)腦組織，而納米銀對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與納米銀的粒徑密切相關(guān)，一般而言粒徑越小毒性越大。有報(bào)道指出到達(dá)腦組織的納米銀可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺耗竭及細(xì)胞毒性。Lee等[17]進(jìn)行的大鼠吸入染毒納米銀14 d研究發(fā)現(xiàn)納米銀影響腦內(nèi)細(xì)胞的基因表達(dá)，其中大腦中有468對基因，小腦中有952對基因的表達(dá)改變是由納米銀引起的；納米銀引起的基因表達(dá)改變與運(yùn)動神經(jīng)元紊亂、神經(jīng)退行性疾病、免疫細(xì)胞功能下降有關(guān)，表明納米銀有潛在的神經(jīng)毒性和免疫毒性。Rahman等[18]為研究納米銀對小鼠不同腦區(qū)基因表達(dá)的影響，分別以0 mg·kg-1、100 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1的納米銀(25 nm)對小鼠進(jìn)行腹腔注射，24 h后，迅速從大腦取出尾狀核、額葉皮質(zhì)和海馬，對這3個區(qū)域的RNA分離提取，實(shí)時(shí)RT-PCR分析采用小鼠氧化應(yīng)激和抗氧化的陣列，陣列數(shù)據(jù)顯示尾狀核、額葉皮質(zhì)和海馬這3個區(qū)域的基因表達(dá)不同，這個研究結(jié)果表明納米粒子(25 nm)可能通過產(chǎn)生自由基引起的氧化應(yīng)激，改變基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Liu等[19]給成年雄性Wistar大鼠鼻腔染毒納米銀14 d后進(jìn)行長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)記錄、Morris水迷宮(MWM)試驗(yàn)并在海馬勻漿中進(jìn)行ROS的檢測；結(jié)果顯示，與對照組相比低劑量組和高劑量組LTP和記憶異常，海馬勻漿中ROS的數(shù)量明顯增多。該研究表明納米銀可造成神經(jīng)損傷。目前，關(guān)于納米銀對神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究還不是很多，且動物試驗(yàn)外推到人時(shí)也有一定的局限性，因此，關(guān)于納米銀的神經(jīng)毒性有待進(jìn)一步探索。

2.4　對生殖系統(tǒng)的毒性

納米銀凝膠常用于治療宮頸炎、宮頸糜爛等女性疾病，從而使女性生殖道與納米銀直接接觸，那么，納米銀是否會對女性生殖系統(tǒng)帶來不良影響，迫切需要毒理學(xué)研究進(jìn)行驗(yàn)證。徐麗明等[20]通過對家兔陰道連續(xù)給藥6 d的試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)納米銀可在不同的生殖器官組織內(nèi)蓄積，陰道黏膜組織、子宮內(nèi)膜組織乃至卵巢組織出現(xiàn)程度不同的超微病理變化，諸如線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、空泡形成等。Melnik等[21]用放射性同位素Ag-110m標(biāo)記的且被PVP包被的納米銀對孕鼠(孕第12天)和哺乳期雌鼠(哺乳第14～16天)以1.69～2.21 mg·kg-1的劑量進(jìn)行灌胃，在灌胃后24 h和48 h用低背景γ譜儀檢測胎鼠和幼鼠體內(nèi)的納米銀含量，結(jié)果顯示48 h到達(dá)胎兒體內(nèi)的納米銀含量為給藥劑量的0.085%～0.147%，這與到達(dá)母體肝、血液、肌肉中的納米銀含量近似，說明納米銀可通過胎盤屏障；在48 h時(shí)檢測到乳汁中納米銀含量為給藥劑量的1.94%±0.29%，且乳汁中超過25%的納米銀會被幼鼠吸收，說明納米銀經(jīng)乳汁傳遞給子代。Charehsaz等[22]對懷孕的SD大鼠在其懷孕的第7到第20天，每天分別以0、0.2、2、20 mg·kg-1·d-1的劑量進(jìn)行灌胃，分娩后立即處死孕鼠和子鼠，并測定其體內(nèi)的Ag含量，評價(jià)肝毒性、氧化應(yīng)激參數(shù)，并進(jìn)行組織病理學(xué)評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比孕鼠體重增加較低，且在子鼠體內(nèi)檢測到Ag的存在，孕鼠和子鼠氧化應(yīng)激水平增加，腦組織病理學(xué)顯示海馬硬化發(fā)病率增高。雖然納米銀胎盤轉(zhuǎn)移的動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能簡單地外推到人，但是胎盤是哺乳動物最具物種特異性的器官，胎盤轉(zhuǎn)移研究是確定納米銀對人體是否具有發(fā)育毒性的關(guān)鍵[23]。

2.5　對皮膚的毒性

皮膚作為人體最大的器官，是抵御病原微生物和外來化學(xué)物質(zhì)入侵機(jī)體的第一道防線，具有重要的保護(hù)和屏障作用。經(jīng)皮接觸是納米銀的主要暴露途徑之一，因此研究納米銀對皮膚的損傷作用尤為重要。Kim等[24]等用納米銀在0～2 000 mg·kg-1的劑量范圍內(nèi)分別對大鼠、家兔和豚鼠進(jìn)行染毒來研究納米銀的皮膚毒性、對眼、皮膚刺激腐蝕性和皮膚致敏性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在皮膚毒性試驗(yàn)中，0～2 000 mg·kg-1的劑量范圍內(nèi)，大鼠沒有出任何異常癥狀和體征；同樣，在家兔的急性眼、皮膚刺激腐蝕實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)對象未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀；但在皮膚致敏試驗(yàn)中，豚鼠皮膚上表現(xiàn)出離散片狀紅斑，表明納米銀有輕微的皮膚致敏性。Samberg等[25]在用0.544 pg·mL-1～34.0 μg·mL-1的納米銀對人的表層角質(zhì)形成細(xì)胞(HEKs)進(jìn)行染毒的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，未清洗的銀納米顆粒使HEKs的生存能力呈劑量依賴性降低，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量增加，顯微鏡和超微結(jié)構(gòu)觀察顯示高劑量組發(fā)生局部炎癥及皮膚角質(zhì)層上層的納米銀聚集。目前關(guān)于納米銀對皮膚的毒性研究尚不充分，現(xiàn)有的科學(xué)研究證明納米銀會造成皮膚發(fā)生炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)；雖然鮮有關(guān)于納米銀對皮膚產(chǎn)生較為嚴(yán)重的毒性作用的報(bào)道，但由于納米銀在各種醫(yī)用輔料及外用藥中應(yīng)用廣泛，與人體皮膚接觸的機(jī)會不亞于任何一種暴露途徑，因此關(guān)于納米銀對皮膚的毒性試驗(yàn)研究還有待加強(qiáng)。

3　納米銀毒作用的影響因素(Influencing factors of toxic effects of silver nanoparticles)

納米銀對機(jī)體的毒性作用受到多種因素的影響，如粒徑、表面修飾及表面電荷等。Recordati等[26]對雄性CD-1小鼠靜脈注射不同粒徑(10、40、100 nm)的納米銀后，發(fā)現(xiàn)納米銀主要集中分布于脾臟和肝臟，其次是肺、腎和腦，且與40、100 nm的納米銀相比10 nm的銀納米顆粒在各器官中的濃度最高，對器官的損傷程度最大，該研究證明納米銀對器官發(fā)揮毒作用呈尺寸依賴性，顆粒越小越容易分布到靶器官，對器官的損傷越嚴(yán)重。有學(xué)者用不同包被(檸檬酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸-谷胱甘肽、阿拉伯樹膠等)的納米銀對青鳉進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)納米銀的表面涂層材料影響Ag+釋放，導(dǎo)致機(jī)體對鈉含量的調(diào)節(jié)受到影響[27]。Long等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)表面為負(fù)電荷的納米銀可導(dǎo)致小鼠血漿中的血漿激肽釋放酶原裂解，使納米銀的分布受到影響，而表面為正電荷或者中性的納米銀則沒有這種效應(yīng)。影響納米銀生物效應(yīng)的因素還有很多，如形狀、攝入劑量、試驗(yàn)對象等等，因此進(jìn)行納米銀生物效應(yīng)研究時(shí)要充分考慮各方面的因素，以確保試驗(yàn)的有效性和可行性。

4　納米銀的毒作用機(jī)制(The toxic mechanism of silver nanoparticles)

有關(guān)納米銀毒性的動物試驗(yàn)大多數(shù)都是通過病理、生化檢查來觀察毒性終點(diǎn)，而對毒作用機(jī)制并沒有進(jìn)行過多深入的探討。目前關(guān)于納米銀的毒作用機(jī)制還不是很清楚，現(xiàn)有的資料普遍認(rèn)為納米銀的毒作用由銀離子(Ag+)釋放、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)介導(dǎo)。最新的研究發(fā)現(xiàn)納米銀的毒性還可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬有關(guān)。

4.1　Ag+釋放

大量證據(jù)表明，納米銀的毒性作用可由粒子表面釋放的銀離子引起[29]。為了研究納米銀的毒作用機(jī)制，Matteis等[30]用完全表征的納米銀對HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)和A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)進(jìn)行染毒，經(jīng)熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)在活細(xì)胞內(nèi)有Ag+存在，Ag+促使金屬硫蛋白激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該試驗(yàn)表明納米銀釋放的Ag+可產(chǎn)生細(xì)胞毒性。Xu等[31]用納米銀對斑馬魚胚胎進(jìn)行染毒，研究發(fā)現(xiàn)納米銀通過釋放Ag+促使斑馬魚載黑素細(xì)胞基因mitfa和dct、神經(jīng)嵴細(xì)胞基因Pax7表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致斑馬魚的黑色素生成受到抑制。該研究證明納米銀在發(fā)揮生物效應(yīng)往往是通過釋放Ag+實(shí)現(xiàn)的。此外，還有學(xué)者證實(shí)納米銀釋放Ag+的速度越快，抗菌活性越顯著[32]。

4.2　ROS產(chǎn)生與氧化應(yīng)激

幾乎所有研究都表明，納米銀可使體內(nèi)ROS濃度增加，所產(chǎn)生的ROS與細(xì)胞膜表面蛋白結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性從而改變細(xì)胞膜的滲透性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。McShan等[33]指出納米銀可穿透細(xì)胞膜，通過產(chǎn)生ROS造成氧化應(yīng)激并破壞細(xì)胞成分，包括：DNA損傷、抗氧化酶的激活、抗氧化分子的消耗(例如，谷胱甘肽)、蛋白質(zhì)加合物生成以及對細(xì)胞膜的損傷。細(xì)胞成分的破壞造成細(xì)胞功能受損，如蛋白質(zhì)氧化修飾產(chǎn)生蛋白質(zhì)自由基、脂質(zhì)過氧化啟動、DNA鏈斷裂、核酸修飾，此外，ROS通過激活氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)炎癥反應(yīng)[34]。納米銀產(chǎn)生ROS作用于細(xì)胞，細(xì)胞的各種抗氧化物質(zhì)SOD、氫酶、谷胱甘肽等含量和活性升高以對抗活性氧ROS的損傷作用，當(dāng)抗氧化作用不足以抵抗活性氧的巨大的作用時(shí)，抗氧化物質(zhì)含量下降，細(xì)胞死亡。此外，研究還發(fā)現(xiàn)納米銀不僅可使正常人肺成纖維細(xì)胞以及人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ROS含量增加，還能夠引起線粒體內(nèi)ATP減少，并造成DNA損傷，細(xì)胞停留在G2期和M期[35]。

4.3　炎癥反應(yīng)

納米銀進(jìn)入機(jī)體后往往通過細(xì)胞內(nèi)信號通路增加ROS的產(chǎn)生進(jìn)而引起氧化應(yīng)激并促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[36]。在用人肝癌細(xì)胞株C3A進(jìn)行納米銀的毒性研究中發(fā)現(xiàn)，納米銀能減少白蛋白的釋放，并且使多種炎癥介質(zhì)IL-8/MIP-2、I1-1R1、TNF-α表達(dá)增加。Braakhuis等[37]在給大鼠吸入暴露不同粒徑的納米銀7 d后，發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)、促炎細(xì)胞因子等肺毒性參數(shù)呈劑量依賴性增加，肺泡壁增厚，多病灶整合，局部炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞質(zhì)水腫，表明納米銀可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。Bermejo-Nogales等[38]用0.003～93.5 μg Ag·mL-1的AgNPs溶液(<20 nm)給魚類細(xì)胞株(PLHC-1細(xì)胞)染毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高劑量暴露組細(xì)胞內(nèi)ROS水平達(dá)到基礎(chǔ)水平的3倍，同時(shí)細(xì)胞中出現(xiàn)許多脂滴和空泡、線粒體和高爾基體腫脹，表明AgNPs可以破壞細(xì)胞器并使細(xì)胞發(fā)生炎癥。需要特別指出的是，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)之間存在“擴(kuò)大循環(huán)”：促炎癥細(xì)胞因子能夠增加氮氧化物/NADPH氧化酶家族的表達(dá)和激活，導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生；除了氧自由基的炎性作用，氧化劑可通過激活轉(zhuǎn)錄因子、低氧誘導(dǎo)因子等調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)之間相互引發(fā)、相互促進(jìn)。也就是說氧化應(yīng)激可能具有雙重作用，既作為效應(yīng)器也作為調(diào)節(jié)器，氧自由基、氧化劑增加炎癥介質(zhì)釋放，促炎細(xì)胞因子促進(jìn)大量自由基的產(chǎn)生。因此，炎癥反應(yīng)也是納米銀產(chǎn)生毒作用不可缺少的原因之一。

4.4　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，其主要功能是折疊胞內(nèi)蛋白質(zhì)，補(bǔ)充脂質(zhì)和固醇，細(xì)胞的氧化性損傷將導(dǎo)致這些重要功能的中斷，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[39]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是體內(nèi)保守細(xì)胞對抗損傷的一種自我保護(hù)機(jī)制[40]。在納米銀對人類細(xì)胞系和斑馬魚的毒性研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可作為細(xì)胞毒性的標(biāo)志[41]。Chen等[42]在用納米銀給小鼠進(jìn)行尾靜脈染毒的研究中發(fā)現(xiàn)，在暴露納米銀8 h后，納米銀迅速分布到各個器官組織中，其中肝和脾中納米銀的含量最豐富，在對這2個器官進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的檢測中發(fā)現(xiàn)，HSP70、BIP、p-IRE1、p-PERK等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白含量顯著增加，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系；xbp-1s和chop等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因在肝的高劑量組中高表達(dá)，而在脾中未發(fā)現(xiàn)異常的變化。該研究證實(shí)納米銀發(fā)揮毒性作用可由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)。

4.5　自噬

作為一種以溶酶體為基礎(chǔ)的胞內(nèi)降解過程，自噬對于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要，基礎(chǔ)水平的自噬與胚胎發(fā)育、病原體防御、細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)等過程密切相關(guān)，納米顆粒對自噬的誘導(dǎo)在過去的10年中一直被深入研討[43]。越來越多的研究表明，自噬作為細(xì)胞的一種防御機(jī)制可被納米顆粒刺激以對抗納米物質(zhì)的毒性作用[44]。自噬的發(fā)生是一個十分復(fù)雜的過程：自噬前體形成，自噬前體延長包裹自噬的底物，自噬泡形成，自噬泡與溶酶體融合完成底物降解。這個過程需要多種蛋白的參與，根據(jù)自噬發(fā)生的不同階段,可把這些核心自噬蛋白分為5類：Atg1/ULK1蛋白激酶復(fù)合體、Vps34-Atg6/Beclin1和III型PI3K復(fù)合體、Atg9/mAtg9、Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)和Atg8/LC3連接系統(tǒng)[45]。

因?yàn)樽允赡軌蜻x擇性去除壓力介導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集及受損細(xì)胞器，因此納米銀誘導(dǎo)的自噬通量缺陷可導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，另外，納米銀能夠干擾泛素修飾，而泛素不僅能夠調(diào)節(jié)自噬的激活、穩(wěn)定和選擇性還能夠影響自噬清除途徑相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，所以自噬清除途徑的受損與納米銀的細(xì)胞毒性有著不可忽視的相關(guān)性[46]。在一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)研究中，Lee等[47]以500 mg·kg-1的劑量對SD大鼠腹腔注射AgNPs(10～30 nm)，在暴露后1、4、7、10、30 d后處死，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1天開始細(xì)胞ATP減少，LC3-II蛋白高表達(dá)，自噬水平在第1天達(dá)到峰值，細(xì)胞凋亡在第4天開始逐漸增加，第10天開始出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。Mishra等[48]研究發(fā)現(xiàn)納米銀可導(dǎo)致HepG-2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B和前自噬蛋白高表達(dá)，激活NLRP3-炎性小體(Caspase-1、IL-1β)，損傷自噬溶酶體途徑，加速乳酸脫氫酶的釋放；Miyayama等[49]發(fā)現(xiàn)納米銀可導(dǎo)致人肺上皮細(xì)胞A549溶酶體功能障礙、細(xì)胞損傷；Lee等[50]的研究同樣表明NIH 3T3細(xì)胞暴露于納米銀后可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、自噬和細(xì)胞凋亡，這些研究均證明納米銀毒作用機(jī)制可能與自噬-溶酶體系統(tǒng)受損有關(guān)。

5　結(jié)語(Summary)

納米技術(shù)的飛速發(fā)展使越來越多的納米產(chǎn)品走進(jìn)人們的生活，人們在享受納米產(chǎn)品給生活帶來極大便利的同時(shí)也受到其對健康所帶來的威脅。綜上所述，納米銀會對機(jī)體的各個系統(tǒng)造成損害，包括消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)等，但大多數(shù)關(guān)于納米銀的毒性研究都是利用動物試驗(yàn)及離體培養(yǎng)細(xì)胞試驗(yàn)得出的結(jié)論，而不同的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁绊懠{米銀的毒作用，納米銀特殊的理化性質(zhì)也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此在由試驗(yàn)結(jié)果外推到人時(shí)僅僅靠毒理學(xué)研究得出的結(jié)論是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還需要更多流行病學(xué)調(diào)查的證據(jù)。此外，目前關(guān)于納米銀的毒作用研究還主要停留在分析其生物分布、細(xì)胞損傷、器官系統(tǒng)損傷等病理研究層面，而對機(jī)制研究開展得較少，到目前為止關(guān)于納米銀的毒作用機(jī)制仍然是一知半解。這提示我們在將來的納米毒理學(xué)研究中，關(guān)于納米銀的毒性機(jī)制的研究任重而道遠(yuǎn)，要盡快探索出納米銀發(fā)揮毒作用的機(jī)制，這樣將有利于促進(jìn)納米銀材料的進(jìn)一步應(yīng)用及發(fā)展并為納米銀產(chǎn)品的危險(xiǎn)度評價(jià)的建立奠定基礎(chǔ)。

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