陶珊珊，葛會林，袁宏球，陽辛鳳

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，?？?571101 2. 華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院，武漢 430070

近代化學物質(zhì)(農(nóng)藥、醫(yī)用藥品、工業(yè)用品、生活用品等)使用日益增多，各方面污染殘留情況日益嚴重，加強污染物殘留與毒性檢測技術(shù)的研究受到越來越多的重視。污染物檢測方法主要有儀器分析、生物檢測和酶抑制法等。儀器分析法主要有氣相色譜、液相色譜以及與質(zhì)譜的聯(lián)用方法等。生物檢測一般使用細菌、細胞、藻類、魚等活體生物來表征污染物的毒性。酶抑制法一般通過污染物對各種酶如乙酰膽堿酯酶、辣根過氧化酶、熒光素酶[1]等的抑制來表征污染物毒性。生物檢測與酶抑制法具有儀器分析法無可替代的特點是可用于表征混合污染物的綜合毒性。酶抑制法相比生物檢測具有操作簡單、重復(fù)性好、測試時間短等特點。

乙酰膽堿酯酶(AChE)最常用于酶抑制法當中，其基本原理是AChE催化底物乙酰膽堿(ATCh)水解得到膽堿，膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)，生成黃色物質(zhì)5-硫代-2-硝基-苯甲酸，通過在412 nm檢測此黃色物質(zhì)的吸光度變化來反映酶催化反應(yīng)的變化[2]。有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對AChE功能有抑制作用，反應(yīng)生成共價結(jié)合的磷?；憠A酯酶或可水解的氨基甲?；憠A酯酶，抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，可通過抑制毒性來判斷出樣品中是否有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在以及殘留情況[3-4]。

AChE抑制法應(yīng)用廣泛且成效顯著，是一種相對成熟的檢測方法[5]，可用于各種AChE抑制劑的篩選[6-8]，以及部分農(nóng)藥殘留的檢測[9]。如AChE抑制法用于蔬菜、水果、茶葉中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留檢測[10]，并制定了相關(guān)的國家標準和農(nóng)業(yè)標準。目前的形勢是需檢的污染物數(shù)目及種類越來越多，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測任務(wù)越來越繁重，所以AChE抑制法還需要進一步的簡化、優(yōu)化與高通量化。

酶抑制實驗的影響因素較多，如pH、溫度、反應(yīng)時間、酶的敏感性等，前人已進行了一些影響因素的條件優(yōu)化研究[11-13]。王小紅[14]觀察到辛硫磷、敵敵畏、樂果在45 ℃對植物酯酶的抑制作用最大。侯學文等[15]使用碘化硫代丁酰膽堿作為底物，觀察到某膽堿酯酶對辛硫磷十分敏感。但少有人研究AChE、DTNB、ATCh濃度對污染物抑制AChE毒性測定的影響。

AChE抑制法通常使用比色管分光光度法測定，這一定程度上制約了其進行多次重復(fù)，也不利于實現(xiàn)高通量操作，而且需要消耗大量的試劑藥品。環(huán)境介質(zhì)中農(nóng)藥的存在形式一般是低劑量與混合殘留[16-17]，為了從單個污染物預(yù)測與評價混合物毒性，需要準確測定單個污染物的低劑量效應(yīng)與全局劑量-效應(yīng)曲線(DRC)，這就需要增加試驗的次數(shù)與重復(fù)性，而使用比色管法無法滿足這樣的要求。

微孔板具有可高通量操作、易于多次重復(fù)、所需試樣體積少等特點，目前越來越多地用于污染物毒性檢測，微孔板可作為酶[1]、發(fā)光菌[18]甚至線蟲[19]的暴露反應(yīng)載體。滅多威作為一種氨基甲酸酯類農(nóng)藥，施用后殘留于環(huán)境形成污染物[20]，本研究以其為例，研究AChE、ATCh、DTNB濃度對滅多威毒性測定的影響，最終建立穩(wěn)定、重復(fù)性好、可高通量操作的AChE抑制法，同時與國標方法進行對比與驗證，為今后AChE抑制法的應(yīng)用與研究提供參考和方法支持。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　儀器與試劑

Synergy2型多功能微孔板測定儀(美國BioTek公司)，AL204型四位電子天平(梅特勒-托利多公司)，雷磁PHS-3E型pH計(上海精密科學儀器有限公司)，96孔透明微板(Corning 9018)。

用于AChE催化體系顯色的物質(zhì)包括碘化硫代乙酰膽堿ATCI(aladdin，純度98%，CAS號1866-15-5)、DTNB(Vetec，純度98%，CAS號69-78-3)、電鰻AChE(Sigma，C3389-2kU，CAS號9000-81-1)。DTNB、ATCI和AChE溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(含0.025 mol·L-1KH2PO4與0.025 mol·L-1Na2HPO4·12H2O)并避光保存于4 ℃冰箱中。為溶解DTNB，參考文獻[2]，每克DTNB添加0.379 g的NaHCO3。受試化合物滅多威(Chem Service，純度99.1%，CAS號16752-77-5)也溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液并避光保存于4 ℃冰箱中。

1.2　乙酰膽堿酯酶體系組分濃度對顯色的影響

進行化學物對AChE的毒性試驗之前，需要了解不同因素對AChE催化體系顯色的影響。本研究采用空調(diào)控溫(29±1) ℃，影響顯色因素實驗的吸光度均為反應(yīng)15 min時在412 nm波長測定。通過固定AChE、DTNB和ATCI其中2種物質(zhì)的濃度，改變另一種物質(zhì)的濃度，研究其與顯色的關(guān)系。其中變化濃度的組分每個濃度8次重復(fù)且加入體積為100 μL，濃度不變的組分加入體積為50 μL。DTNB與ATCI濃度為0.25 g·L-1時，各列AChE濃度依次為1、0.7、0.49、0.34、0.24、0.17、0.12、0.082、0.058、0.04、0.028、0.02 U·mL-1；ATCI濃度為0.25 g·L-1，AChE濃度為0.05 U·mL-1，各列DTNB濃度依次為5、2.5、1.25、0.65、0.315、0.155、0.08、0.039、0.0195、0.01、0.005 g·L-1；DTNB濃度為0.25 g·L-1，AChE濃度為0.05 U·mL-1，各列ATCI濃度依次為5、2.5、1.25、0.65、0.315、0.155、0.08、0.039、0.0195、0.01、0.005 g·L-1。

1.3　乙酰膽堿酯酶微板毒性分析

參考發(fā)光菌的微板毒性分析[18]，建立乙酰膽堿酯酶的微板毒性分析程序如下。將96孔微板第12列的8個孔加入100 μL磷酸鹽緩沖液作為空白對照，其余11列加入按一定稀釋因子設(shè)計的11個濃度梯度污染物100 μL，每個濃度8個重復(fù)，接著每孔依次加入50 μL 1 g·L-1DTNB、50 μL 1 g·L-1ATCI與 50 μL 0.2 U·mL-1AChE，每孔總體積共250 μL，然后將微板送入酶標儀中測定吸光度(A)，默認的暴露時間為15 min。

污染物對AChE的抑制毒性E按照公式(1)計算，得到的劑量-效應(yīng)曲線(DRC)使用公式(2)所示W(wǎng)eibull函數(shù)進行最小二乘法擬合，并計算觀測值的95%置信區(qū)間[21]，得到典型效應(yīng)濃度如EC90、EC50、EC10等。

E=1-△At/△Ac

(1)

E=1-exp(-exp(a+b×log10(C)))

(2)

式中ΔAt為與0 min相比處理吸光度變化值，ΔAc為與0 min相比空白吸光度變化值，C為濃度，E為效應(yīng)，a為位置參數(shù)，b為斜率參數(shù)。

1.4　污染物抑制乙酰膽堿酯酶毒性的影響因素

為研究暴露時間對污染物抑制AChE的影響，測定暴露時間為5、10、15、20、25、30 min時滅多威抑制AChE的DRC。

通過固定AChE、ATCI、DTNB其中2種物質(zhì)的濃度，改變另一種物質(zhì)的濃度，測定滅多威抑制AChE 15 min的DRC，研究AChE、ATCI、DTNB濃度對滅多威抑制AChE的影響。其中DTNB與ATCI濃度為0.2 g·L-1時，AChE濃度選取0.004、0.01、0.04、0.16 U·mL-1；ATCI濃度為0.2 g·L-1，AChE濃度為0.04 U·mL-1，DTNB濃度選取0.02、0.2、2 g·L-1；DTNB濃度為0.2 g·L-1，AChE濃度為0.04 U·mL-1，ATCI的濃度選取0.02、0.2、2 g·L-1。

1.5　方法驗證

以國標GB/T 5009.199—2003[22]中的酶抑制法(此后簡稱國標法)作為參考對本研究方法進行驗證。國標法中，采用pH 8.0的KH2PO4-K2HPO4緩沖液，DTNB與AChE用緩沖液配制，每克DTNB添加0.0975 g的NaHCO3，ATCI用純水配制，反應(yīng)溶液中ATCI與DTNB的終濃度分別為0.298 g·L-1與0.286 g·L-1；AChE濃度沒有明確指定，此處采用0.04 U·mL-1。檢測方式為2.5 mL樣品溶液，加入0.1 mL AChE、0.1 mL DTNB，搖勻后于37 ℃放置最少15 min，再加入0.1 mL ATCI，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值。為與微板法對比，將國標法換算后移植到微板上進行，加樣體積為處理/空白100 μL+AChE 50 μL+DTNB 50 μL+ATCI 50 μL。因為國標法測試分溫浴和顯色2個階段，加樣順序會對測試結(jié)果有影響。所以我們設(shè)計了板(36)的AChE+DTNB+ATCI (稱國標法)、板(37)的AChE+ATCI+DTNB (稱國標法變異1)、板(38)的DTNB+ATCI+AChE (稱國標法變異2)3種加樣順序；3種物質(zhì)中前兩者37 ℃溫浴15 min，再加第3種物質(zhì)顯色并在37 ℃測試；相應(yīng)地暴露時間表示為溫浴時間(15 min)加上實際顯色時間，但國標法變異2的溫浴時間不算在暴露時間內(nèi)。

2　結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1　乙酰膽堿酯酶體系組分濃度對顯色吸光度的影響

圖1(a)為不同AChE濃度下的吸光度曲線，可以看出隨著AChE濃度(0.02～1 U·mL-1)的增加，吸光度相應(yīng)增加，從0.173到2.212。類似地，余淑英等[23]報道AChE濃度在0～0.0667 U·mL-1范圍與吸光度保持良好的線性關(guān)系，并建議反應(yīng)體系酶終濃度應(yīng)控制在0.0667 U·mL-1以內(nèi)。圖1(b)為不同DTNB濃度下的吸光度曲線，隨著DTNB濃度(0.005～5 g·L-1)的增加，吸光度也相應(yīng)增加，從0.138到1.332。圖1(c)為不同ATCI濃度下的吸光度曲線，隨著ATCI濃度(0.005～5 g·L-1)的增加，吸光度也相應(yīng)增加，從0.138到1.834。有研究表明，ATCh濃度與吸光度存在雙相關(guān)系[24]，轉(zhuǎn)折點對應(yīng)的ATCh濃度約3.3 mmol·L-1(即0.95 g·L-1的ATCI)。本研究中沒有觀察到ATCI濃度對吸光度的雙相關(guān)系，原因有待進一步研究。

2.2　乙酰膽堿酯酶體系組分濃度對顯色吸光度變化速率的影響

將圖1中15 min測定的A值分別減去0 min的A值，所得差值除以15 min即為吸光度的變化速率(ΔA·min-1)，可以看出AChE、DTNB與ATCI濃度與吸光度變化速率呈現(xiàn)出完全不同類型的曲線(圖2)。隨著AChE濃度的增加，吸光度變化速率呈現(xiàn)遞增的曲線(圖2a)。隨著DTNB濃度的增加，吸光度變化速率呈現(xiàn)基本水平的曲線(圖2b)，每分鐘A值的變化量約為0.004。而隨著ATCI濃度的增加，吸光度變化速率呈現(xiàn)先增后減的雙相曲線(圖2c)，最大值出現(xiàn)在ATCI濃度為0.315 g·L-1(即1.09 mmol·L-1)，這反映了AChE的過量底物抑制效應(yīng)；建議采用上升階段曲線，ATCI的濃度以小于0.315 g·L-1為宜。Ellman等[2]報道牛紅細胞膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解速率也呈現(xiàn)先增后減的雙相曲線，其最大值出現(xiàn)在乙酰膽堿濃度約為0.5 mmol·L-1。但丁酰膽堿酯酶(BChE)無過量底物抑制效應(yīng)，如雞血清BChE[9]，這也是區(qū)分AChE和BChE的特性之一[25]。

圖1　影響乙酰膽堿酯酶催化體系顯色吸光度的因素注：(a) 乙酰膽堿酯酶(AChE)濃度；(b) 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)濃度；(c) 碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)濃度。Fig. 1　Factors affecting the absorbance of AChE catalytic systemNote: (a) acetylcholinesterase (AChE) concentration; (b) 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) concentration; (c) acetylthiocholine iodide (ATCI) concentration.

圖2　影響乙酰膽堿酯酶催化體系顯色吸光度變化速率的因素Fig. 2　Factors affecting the change rate of absorbance of AChE catalytic system

2.3　污染物抑制乙酰膽堿酯酶的影響因素研究

圖3(a)為不同暴露時間下滅多威的DRC，可以看出隨著暴露時間的增加滅多威DRC向左移動，滅多威的毒性隨之增大，表1中EC50隨之減小，5、15、30 min時分別為5.08×10-6、2.41×10-6、1.60×10-6mol·L-1。可以看出15 min后毒性變化已不大，考慮試驗效率等因素并參考慣例，選擇15 min作為毒性測試默認的暴露時間。

圖3(b)為AChE濃度為0.004、0.01、0.04、0.16 U·mL-1時滅多威的DRC，這4條DRC基本重合，表明一定范圍內(nèi)AChE濃度變化不會對污染物的毒性測試產(chǎn)生影響。李維[9]也發(fā)現(xiàn)不同比酶活力的雞血清BChE對農(nóng)藥的抑制率基本相同。圖3(c)為DTNB濃度為0.02、0.2、2 g·L-1時滅多威的DRC，這3條DRC基本重合，表明一定范圍內(nèi)DTNB濃度變化也不會對污染物的毒性測試產(chǎn)生影響。

表1　滅多威抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)模型及相關(guān)參數(shù)Table 1　Dose-response model of methomyl inhibiting acetylcholinesterase and related parameters

注：T為暴露時間，單位為min；CAChE為反應(yīng)溶液中的AChE濃度，單位為U·mL-1；CDTNB與CATCI為反應(yīng)溶液中DTNB與ATCI的濃度，單位為g·L-1；a與b為Weibull模型的位置與斜率參數(shù)；R2為擬合決定系數(shù)；RMSE為均方根誤差；EC10、EC50、EC90為產(chǎn)生10%、50%、90%效應(yīng)的濃度，單位為mol·L-1。

Note: T is the exposure time with the unit minute; CAChEis the concentration of AChE in the reaction solution with the unit U·mL-1; CDTNBand CATCIare the concentrations of DTNB and ATCI in the reaction solution with the unit g·L-1; a and b are the location parameter and slope parameter for Weibull model; R2is the fitting coefficient of determination; RMSE is the root mean square error; EC10,EC50and EC90are the 10%, 50% and 90% effect concentration with the unit mol·L-1.

圖3(d)為不同ATCI濃度下滅多威的DRC，可見隨著ATCI濃度的增大，DRC向右大幅度移動。滅多威的毒性隨著ATCI濃度的增大而減小，其EC50在ATCI濃度為0.02、0.2、2 g·L-1時分別為6.75×10-7、2.26×10-6、1.12×10-5mol·L-1，其中最大值是最小值的16.6倍，所以ATCI濃度變化能顯著影響污染物對AChE的抑制毒性。所以，ATCI濃度是決定化學物抑制AChE毒性的關(guān)鍵參數(shù)，不同文獻中若ATCI濃度不一樣，得到的化學物抑制AChE的EC50一般是沒有可比性的，這對于AChE抑制法的研究與應(yīng)用具有重要的參考意義。此結(jié)果一個潛在的含義是可通過改變ATCI濃度來調(diào)控污染物抑制AChE毒性的大小，ATCI作用類似于一個化學探針，為使毒性指標更靈敏，在保證重復(fù)性的前提下，可適當降低ATCI的濃度。可以預(yù)計熒光素酶毒性試驗中[1]，三磷酸腺苷(ATP)也有類似于ATCI的作用，ATP濃度變化應(yīng)能顯著影響化學物對熒光素酶的毒性。反而AChE濃度不影響滅多威毒性測試結(jié)果。文獻報道滅多威是與AChE活性位點以外的部位結(jié)合，為非競爭性抑制，主要通過改變酶分子的形狀而產(chǎn)生抑制[26]。同時，滅多威對AChE的抑制作用是可逆的[27-28]。從研究結(jié)果、試劑成本因素等方面綜合考慮，確定最終優(yōu)化實驗濃度為DTNB 0.2 g·L-1、ATCI 0.2 g·L-1與AChE 0.04 U·mL-1。優(yōu)化的酶濃度也在文獻[23]建議的濃度范圍內(nèi)。

2.4　方法驗證與總結(jié)

從圖3(e)與表1可以看出，板(38)的國標法變異2與板(3)的本研究方法所測結(jié)果基本一致，板(38)所測EC50是板(3)1.32倍，國標法變異2與本研究方法結(jié)果基本是等同的，兩者具有相近的穩(wěn)定性與靈敏度。板(39)為采用國標法中的溶液濃度，加樣順序按照本研究方法DTNB+ATCI+AChE，并立即在29 ℃檢測?？梢钥闯霭?38)在37 ℃所測EC50是板(39)在29 ℃的1.04倍，幾乎完全一樣，所以AChE酶抑制法對于溫度是不敏感的。板(39)所測EC50是板(3)的1.27倍，所以pH在一定范圍內(nèi)如6.8～8.0對測試結(jié)果的影響不大。板(38)與(39)所測DRC隨時間增加向左移動，與板(3)的變化規(guī)律一致。但是，板(36)的國標法與板(37)的國標法變異1與板(3)的本研究方法所測結(jié)果差異顯著，板(3)的15 min的EC50分別是板(36)、(37)的(15+3) min的EC50的19.8、3.1倍！板(36)所測毒性也遠較板(37)大，我們認為主要與板(36)溫浴15 min的暴露過程中沒有ATCI與滅多威競爭酶作用位點有關(guān)。相比板(3)，板(36)與(37)溫浴15 min過程中雖然已處于暴露階段，但抑制率只能在顯色后的時間進行計算，這可稱為瞬時抑制率，而板(3)可稱為平均抑制率，這一定程度上可能導致板(3)所測毒性偏小。圖3(f)顯示板(36)所測DRC隨時間增加向右移動，圖3(g)表明板(37)所測DRC基本不移動，這與板(3)所測DRC左移即人們通常認為的一段時間內(nèi)隨著時間增加而毒性增加的規(guī)律是有差異的。以EC90/EC10來表示毒物發(fā)揮毒性效應(yīng)的范圍，從表1可以看出，隨著時間增加，板(3)與(36)的此范圍不斷加寬，但板(37)的范圍不斷變窄。

圖3　影響滅多威抑制乙酰膽堿酯酶劑量-效應(yīng)曲線的因素注：(a, f, g) 暴露時間；(b) AChE濃度；(c) DTNB濃度；(d) ATCI濃度；(e) 試劑加樣順序。Fig. 3　Factors affecting the dose-response curves of methomyl inhibiting acetylcholinesteraseNote: (a, f, g) Exposure time; (b) AChE concentration; (c) DTNB concentration; (d) ATCI concentration; (e) Reagent injection sequence.

圖4為3種典型加樣順序條件下滅多威抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)曲線。國標法(圖4a)具有最高的靈敏度，適合于農(nóng)藥低劑量殘留等的檢測。國標法變異1(圖4b)的優(yōu)點是測試毒性對時間因素不敏感，適合于要求結(jié)果高穩(wěn)定性的實驗。我們研究方法(圖4c)的特點是更符合生物體中AChE與ATCh同時存在的特征，同時測試方法能全面完整反映暴露全過程的毒性變化。

綜合來看，AChE抑制率與滅多威濃度成S型DRC關(guān)系，可用Weibull函數(shù)有效表征，擬合決定系數(shù)R2>0.97，擬合均方根誤差RMSE<0.07，空白變異控制在了±10%以內(nèi)。滅多威毒性測試結(jié)果重復(fù)性較好，低濃度毒性變化趨勢較為合理，DRC曲線覆蓋范圍全面。這與文獻[1]中熒光素酶毒性測試結(jié)果的重復(fù)性相當。基于比色管分光光度的國標法[22]中，以E≥50%作為陽性標準，滅多威的檢出限為6.16×10-7mol·L-1；本研究中基于微板分光光度的國標法的EC50為1.22×10-7，后者相比前者具有更高的靈敏度。但本文提出的方法尚需要進一步開展標準化研究，通過與國內(nèi)外現(xiàn)行標準方法進行平行比較研究，進一步驗證方法的可靠性。

通過研究可以看出，影響污染物抑制AChE的因素主要有ATCI濃度的準確性、污染物濃度的準確性、試劑加樣順序等。不同污染物在不同pH條件下的穩(wěn)定性不同，在保證酶活性較高的情況下，本試驗使用磷酸鹽緩沖液控制反應(yīng)體系pH值6.8，能最大程度適合大多數(shù)污染物的毒性測試。使用空調(diào)控溫反應(yīng)在(29±1) ℃，不需要額外的控溫手段，操作更加簡單便利。AChE微板毒性分析，使用稀釋因子得到等對數(shù)間距濃度污染物，能保證效應(yīng)從高到低完整覆蓋DRC的有效范圍。ATCI加入體積占每孔總體積的1/5，保證了ATCI濃度的準確性，以及每個處理的8次重復(fù)，都保證了DRC測試的有效重復(fù)。本研究建立的AChE微板毒性分析法，一塊微板，一次測定，即得到樣品一條完整的劑量-效應(yīng)曲線，具有操作程序化、普適化、高通量、結(jié)果重復(fù)性好等特點，適合環(huán)境污染物毒性的高通量測試，也可用于AChE抑制劑的篩選等工作。

圖4　3種典型加樣順序下滅多威抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)曲線注：□，空白控制；○，實驗數(shù)據(jù)；—，Weibull模型擬合曲線；┄，置信區(qū)間。Fig. 4　Dose-response curves of methomyl inhibiting acetylcholinesterase at three typical injection sequencesNote: □, Blank Control; ○, Experimental data; —, Weibull model fit; ┄, Confidence interval.

致謝：感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所賈瑞宗博士在文章修改中給予的幫助。感謝審稿人對文章提出的有建設(shè)性的修改意見。

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