蔡榮, 郭賽男, 鄭家浪

浙江海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，舟山 316000

鎘(Cd)是非必需金屬元素，即使很低劑量也能對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物產(chǎn)生巨大的毒性[1]。在正常的淡水中，Cd2+的濃度介于10到500 ng·L-1之間[2]，然而，在我國(guó)的灤河流域Cd2+的濃度為1.120～4.474 μg·L-1 [3]，在武漢東湖西南湖區(qū)為8 μg·L-1[4]，在龍江重污染河段甚至達(dá)到800 μg·L-1[5]。目前，Cd已經(jīng)成為局部水生生態(tài)系統(tǒng)的主要污染源。

Cd主要通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和免疫毒性對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生廣泛的毒性影響[4]。因此，搜尋一種合適的抗氧化劑或者免疫增強(qiáng)劑以提高魚(yú)類(lèi)對(duì)金屬的耐受性成為目前研究的熱點(diǎn)。例如，水體中加入腐殖酸或者飼料添加肌醇可以明顯增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)抗氧化和免疫能力，緩解金屬暴露誘導(dǎo)的損傷[7-8]。發(fā)光二極管(LED)具有能耗低、發(fā)出光單色性高和壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。盧菁菁和李敦海[9]的研究表明，不同光質(zhì)LED能影響念珠藻葛仙米生長(zhǎng)并對(duì)生理生化產(chǎn)生顯著影響。Villamizar等[10]暗示藍(lán)LED光 (LDB) 能促進(jìn)鱸魚(yú)的生長(zhǎng)和發(fā)育。其他的一些有關(guān)魚(yú)類(lèi)的研究證明，LDB能緩解饑餓或者高溫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[11-12]。但是，到目前為止，沒(méi)有任何研究報(bào)道LDB預(yù)暴露對(duì)隨后金屬暴露的正面影響。最近我們課題組的幾項(xiàng)研究表明，藍(lán)LEDs(LDB)不僅能促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育，而且能增強(qiáng)免疫力和緩解氧化應(yīng)激[13-15]。因此，當(dāng)前研究的假設(shè)是LDB預(yù)暴露可以緩解Cd暴露引起的氧化性損傷和免疫毒性。

魚(yú)類(lèi)依賴(lài)抗氧化防御系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)環(huán)境威脅。在抗氧化系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是其重要指標(biāo)。在免疫系統(tǒng)中，環(huán)氧合酶-2 (COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)都是炎癥過(guò)程中的早期反應(yīng)基因。一方面，這些基因受轉(zhuǎn)錄因子控制。例如，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nrf2)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)調(diào)控著相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和免疫毒性過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6, 16]。另一方面，這些轉(zhuǎn)錄因子又受其抑制子調(diào)節(jié)。抑制因子Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)和抑制蛋白激酶(IκBα)分別結(jié)合Nrf2 和 NF-κB，使其處于失活狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，Keap1和IκBα磷酸化導(dǎo)致抑制子從轉(zhuǎn)錄因子解離，進(jìn)而誘導(dǎo)Nrf2和NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活。本研究以斑馬魚(yú)為研究模型，分析急性Cd暴露對(duì)斑馬魚(yú)抗氧化系統(tǒng)和免疫反應(yīng)的影響，評(píng)估藍(lán)LEDs (LDB)預(yù)暴露可能的緩解作用，探討可能的分子機(jī)制，為處理金屬毒性提供策略措施，為魚(yú)類(lèi)健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

AB系斑馬魚(yú)于室內(nèi)預(yù)暴露2周。相同規(guī)格的斑馬魚(yú)(初始體重(0.19 ± 0.02) g, mean ± SEM)為2組，分別用白熾燈和LDB處理4周 (輻照度為0.9 W·m-2)。4周后每組再分為2個(gè)小組，分別在白熾燈下用0和0.97 mg·L-1Cd2+的水體處理4 d。共有4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)80尾魚(yú)，包括(1) 正常對(duì)照組；(2) Cd處理組：?jiǎn)为?dú)0.97 mg·L-1Cd2+暴露組；(3)LDB預(yù)處理組；(4) LDB預(yù)處理+Cd暴露組。Cd濃度和輻照度的設(shè)定參照我們近期的研究[6, 14]。試驗(yàn)期間每天早上7點(diǎn)換水100%，隨后加入Cd的母液到理論濃度。斑馬魚(yú)每天按照體重的1%投喂量分別在早上8點(diǎn)、下午3點(diǎn)和晚上9點(diǎn)投喂。試驗(yàn)期間定期檢測(cè)水質(zhì)：水溫(25.8 ± 0.4) ℃，光周期12 h L:12 h D，溶解氧(7.46 ± 0.34) mg·L-1，pH值7.49 ± 0.17。對(duì)照組的Cd濃度為0，Cd處理組水體Cd濃度為(0.97 ± 0.04) mg·L-1。采用火焰原子吸收光譜法(FAAS)測(cè)量金屬濃度。

1.2　樣品采集和勻漿液準(zhǔn)備

取樣之前，魚(yú)禁食24 h，然后使用0.02%的MS-222麻醉。隨機(jī)取魚(yú)在冰袋上進(jìn)行肝臟和卵巢樣本采集。樣本采集后立即放入凍存管中，然后用液氮速凍，最后置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

肝臟和卵巢組織用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH 7.4)在玻璃勻漿器中冰浴勻漿。勻漿液離心(20 min、5 000 r·min-1、4 ℃)后取上清液，立即進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3　抗氧化和免疫指標(biāo)測(cè)定

采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定Cu/Zn-SOD的活力；采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)法測(cè)定CAT活力；采用精氨酸轉(zhuǎn)化法測(cè)定iNOS活性；采用放射免疫法測(cè)定COX-2活性[17]；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA 含量；采用硝酸還原酶法測(cè)定NO含量；采用考馬斯亮蘭法測(cè)定樣品總蛋白。除COX-2外所有指標(biāo)的測(cè)定采用南京建成試劑盒，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)采用4次生物學(xué)重復(fù)和2次技術(shù)性重復(fù)。

1.4　基因表達(dá)測(cè)定

組織總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成參照我們最近的研究[16]。采用Applied Biosystems Prism 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，參照SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara) 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR。引物序列詳見(jiàn)表1。每對(duì)引物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)只有單一條帶，不同的引物在擴(kuò)增效率上沒(méi)有顯著差異。以β-Actin和GAPDH幾何平均數(shù)作為相對(duì)定量?jī)?nèi)參[16]，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5　統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較。數(shù)據(jù)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)前用單樣本Kolmogorov Smirnow檢驗(yàn)和Levene方差齊次性檢驗(yàn)分別確定其分布型和方差同質(zhì)性。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著度水平為0.05。

2　結(jié)果(Results)

2.1　LDB預(yù)暴露對(duì)Cd2+暴露斑馬魚(yú)MDA和NO含量的影響

與對(duì)照組相比，急性Cd2+暴露組MDA和NO的含量在肝臟和卵巢中顯著升高(P < 0.05) (圖1)。LDB預(yù)暴露組MDA和NO的含量在肝臟和卵巢中沒(méi)有顯著變化(P > 0.05)。在LDB預(yù)暴露+Cd2+暴露組中，MDA和NO的含量在卵巢中沒(méi)有顯著變化(P > 0.05)，在肝臟中仍處于較高的水平(P < 0.05)。

2.2　抗氧化反應(yīng)

與對(duì)照組相比，急性Cd2+暴露導(dǎo)致了肝臟Cu/Zn-SOD和CAT的酶活和表達(dá)的顯著下降 (P < 0.05) (圖2)。Cd2+暴露也導(dǎo)致卵巢CAT的酶活和表達(dá)以及Cu/Zn-SOD的表達(dá)顯著上升(P < 0.05)。在LDB預(yù)暴露+Cd2+暴露組中，Cu/Zn-SOD和CAT在肝臟中的表達(dá)水平以及在卵巢中的表達(dá)和活性水平維持在正常水平(P > 0.05)，并且在肝臟中的酶活顯著上升(P < 0.05)。除了能誘導(dǎo)肝臟CAT的表達(dá)升高外(P < 0.05)，LDB預(yù)暴露不能顯著影響以上指標(biāo)(P > 0.05)。

2.3　炎癥反應(yīng)

與對(duì)照組相比，急性Cd2+暴露導(dǎo)致了肝臟COX-2和iNOS的酶活和表達(dá)的顯著上升 (P < 0.05)，也導(dǎo)致卵巢COX-2和iNOS的酶活顯著上升(P < 0.05)，但并不顯著影響卵巢COX-2和iNOS的表達(dá)(P > 0.05) (圖2)。在LDB預(yù)暴露+Cd2+暴露組的肝臟中，COX-2和iNOS的表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照水平(P > 0.05)，但是COX-2和iNOS的酶活仍顯著上升(P < 0.05)。在LDB預(yù)暴露+Cd2+暴露組的卵巢中，COX-2和iNOS的酶活恢復(fù)到對(duì)照水平(P > 0.05)，但是COX-2的表達(dá)水平仍較高(P < 0.05)。除了能誘導(dǎo)肝臟COX-2的表達(dá)下降外(P < 0.05)，LDB預(yù)暴露不能顯著影響以上指標(biāo)(P > 0.05)。

2.4　轉(zhuǎn)錄因子及其抑制因子的表達(dá)

與對(duì)照組相比，急性Cd2+暴露組肝臟中Nrf2、Keap1a、Keap1b、NF-κB和IκBαa的表達(dá)水平顯著上升(圖4A) (P < 0.05)。在Cd2+暴露組卵巢中Nrf2和NF-κB的表達(dá)增加，Keap1a和IκBαa的表達(dá)減少(圖4B)(P < 0.05)。在LDB預(yù)暴露+Cd2+暴露組的肝臟中Nrf2、Keap1a、Keap1b、NF-κB和IκBαa的表達(dá)恢復(fù)到正常水平(P > 0.05)，IκBαa的表達(dá)水平顯著增加(P < 0.05)。在LDB預(yù)暴露+Cd2+暴露組的卵巢中Nrf2、Keap1a和NF-κB的表達(dá)恢復(fù)到正常水平(P > 0.05)，Keap1b和IκBαa的表達(dá)水平顯著增加(P < 0.05)。除減少肝臟NF-κB的表達(dá)和增加IκBαa的表達(dá)以及增加卵巢IκBαb的表達(dá)外(P < 0.05)，LDB預(yù)暴露不能顯著影響以上指標(biāo)(P > 0.05)。

圖2　LDB預(yù)暴露對(duì)急性Cd2+暴露斑馬魚(yú)肝臟和卵巢抗氧化酶活性和表達(dá)的影響注: *與對(duì)照相比, P < 0.05。Fig. 2　Effects of LDB acclimation on mRNA levels and activity of antioxidant enzymes in liver and ovary of zebrafish acutely exposed to Cd2+Note: * denotes significant differences (P<0.05) with control group.

圖3　LDB預(yù)暴露對(duì)急性Cd2+暴露斑馬魚(yú)肝臟和卵巢免疫相關(guān)酶活性和表達(dá)的影響注: *與對(duì)照相比, P < 0.05。Fig. 3　Effects of LDB acclimation on mRNA levels and activity of enzymes related to immunity in liver and ovary of zebrafish acutely exposed to Cd2+Note: * denotes significant differences (P<0.05) with control group.

圖4　LDB預(yù)暴露對(duì)急性Cd2+暴露斑馬魚(yú)肝臟(A)和卵巢(B)轉(zhuǎn)錄因子及其抑制因子表達(dá)的影響注：*與對(duì)照相比，P < 0.05。Fig. 4　Effects of LDB acclimation on mRNA levels of transcription factors and their inhibitors in liver (A) and ovary (B) of zebrafish acutely exposed to Cd2+Note: * denotes significant differences (P<0.05) with control group.

2.5　轉(zhuǎn)錄因子與其目的基因及其抑制因子表達(dá)的相關(guān)性

如表2所示，Nrf2的表達(dá)與其目的基因Cu/Zn-SOD和CAT的表達(dá)在卵巢中呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性，但是在肝臟中呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。Nrf2的表達(dá)與其抑制因子Keap1a和Keap1b的表達(dá)在肝臟中呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。在肝臟中，NF-κB的表達(dá)與其目的基因iNOS和COX-2顯示顯著的正相關(guān)性，與IκBαb的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。在卵巢中，NF-κB與IκBαa的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。

3　討論(Discussion)

Cd主要通過(guò)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)，反應(yīng)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙[18-20]。NO作為魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要信號(hào)分子，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并且在魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)損傷和細(xì)胞凋亡中起著重要作用[21]。本研究中，Cd暴露顯著提高了斑馬魚(yú)肝臟和卵巢MDA和NO水平，表明Cd暴露導(dǎo)致了氧化性損傷和免疫毒性。該結(jié)果和我們近期的研究相符[6, 13, 16]。此外，我們的研究揭示了LDB預(yù)暴露具有緩解Cd毒性的作用。例如，在Cd暴露+ LDB預(yù)暴露組中，斑馬魚(yú)卵巢MDA和NO的含量恢復(fù)到正常水平。盡管在Cd暴露+ LDB預(yù)暴露組肝臟中MDA和NO含量相對(duì)于對(duì)照仍處于較高水平，但是絕大部分氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。當(dāng)前的研究結(jié)果表明：早期LDB暴露的斑馬魚(yú)在后期能更好地抵御外源刺激物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和免疫毒性。Bayarri等[22]的研究表明藍(lán)光能有效地誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)松果體和視網(wǎng)膜褪黑素的產(chǎn)生。產(chǎn)生的褪黑素經(jīng)由血液循環(huán)到達(dá)肝臟和卵巢，可能緩解應(yīng)激的負(fù)面影響[23]。另一方面，LDB預(yù)暴露很有可能導(dǎo)致了細(xì)胞防御機(jī)制的提前動(dòng)員使之能迅速地響應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)[24]。

金屬暴露會(huì)干擾線粒體的功能，產(chǎn)生更多的活性氧(ROS)，進(jìn)而形成氧化應(yīng)激[25]。生物體在進(jìn)化過(guò)程中形成了抗氧化防御系統(tǒng)以抵御ROS的損傷。在抗氧化系統(tǒng)中，SOD是一種重要的抗氧化性酶類(lèi)，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，解除超氧陰離子對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用[26]。CAT是生物氧化中的末端氧化酶，能分解生物體某些代謝物需氧脫氫后所產(chǎn)生的對(duì)機(jī)體有害物質(zhì)的一種酶，具有一定的解毒功能[27]。本研究中，卵巢Cu/Zn-SOD和CAT的表達(dá)以及CAT的活性在單獨(dú)Cd暴露條件下顯著上升，表明抗氧化系統(tǒng)被激活。相似地，斑馬魚(yú)胚胎在115 μg·L-1Cd的水體中暴露4 d，Cu/Zn-SOD和CAT的表達(dá)和Cu/Zn-SOD的活性增加[2]，在570 μg·L-1Cd的水體中暴露4 h，CAT的表達(dá)升高[28]。Wang等[29]研究顯示河豚在5 mg·L-1Cd的水體中暴露4 h，肝臟SOD活性增加。然而，抗氧化系統(tǒng)的激活可能并不足以清除過(guò)量的ROS，從而導(dǎo)致卵巢脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著增加。過(guò)量的ROS會(huì)增加氧化性損傷風(fēng)險(xiǎn)，反過(guò)來(lái)降低肝臟抗氧化酶的活性[30]。在Cd暴露+LDB預(yù)暴露條件下，Cu/Zn-SOD和CAT在肝臟中的表達(dá)以及在卵巢中的活性和表達(dá)都恢復(fù)到正常水平，在肝臟中的酶活大幅增加。以上的結(jié)果表明，LDB預(yù)暴露有助于緩和Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。氧化還原的平衡是機(jī)體行使正常免疫反應(yīng)的前提[31]。iNOS和COX-2是炎癥響應(yīng)過(guò)程中的早期基因，被認(rèn)為炎癥標(biāo)記物。在炎癥反應(yīng)模型中，iNOS和COX-2往往被協(xié)同誘導(dǎo)[32]。在Cd暴露組中，iNOS和COX-2在卵巢中的表達(dá)和酶活都顯著上升，表明了Cd引起了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。LDB預(yù)暴露緩解了這些指標(biāo)的過(guò)度增加，表明LDB預(yù)暴露具有抵抗Cd誘導(dǎo)的炎癥的作用。相反，在Cd暴露+LDB預(yù)暴露組的肝臟中，iNOS和COX-2的酶活相對(duì)于對(duì)照組仍處于較高水平，暗示LDB預(yù)暴露在肝臟中并沒(méi)有緩解炎癥的作用。然而，我們注意到的是，LDB預(yù)暴露導(dǎo)致Cd誘導(dǎo)的iNOS和COX-2的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。我們猜想從mRNA水平到蛋白質(zhì)或者活性水平，存在一個(gè)時(shí)間效應(yīng)。這可能導(dǎo)致盡管iNOS和COX-2的mRNA水平不變，但是它們的活性仍處于較高水平。

表2　轉(zhuǎn)錄因子與其目的基因及其抑制因子之間的相關(guān)性分析Table 2　Correlation coefficients between mRNA levels of transcription factors and their target genes and inhibitors

Cd的毒性和ROS的大量聚集有關(guān)。在Cd暴露組中，組織過(guò)高的脂質(zhì)過(guò)氧化水平反映了大量ROS的形成。相應(yīng)地，ROS含量的增加能通過(guò)ROS/Nrf2和ROS/NF-κB信號(hào)通路分別激活抗氧化和炎癥反應(yīng)[33-34]。在Cd暴露+LDB預(yù)暴露條件下，斑馬魚(yú)肝臟和卵巢中Nrf-2和NF-κB的表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平，表明LDB預(yù)暴露對(duì)Cd誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有改善作用。在這過(guò)程中，卵巢Keap1b和IkBαa和肝臟IkBαa的表達(dá)水平升高。這將有助于形成反饋抑制從而控制Nrf2和NF-κB的豐度[35]。Nrf-2結(jié)合抗氧化基因的啟動(dòng)子區(qū)的ARE序列來(lái)激活下游基因轉(zhuǎn)錄[36]。NF-κB調(diào)控大量炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[37]。相應(yīng)地，卵巢Nrf-2與其目的基因(Cu/Zn-SOD和CAT)，肝臟NF-κB與其目的基因(iNOS和COX-2)均顯著正相關(guān)。然而，我們也可以注意到，肝臟Nrf-2與其目的基因，卵巢NF-κB與其目的基因沒(méi)有顯著的相關(guān)性。這可能涉及組織特異性的調(diào)節(jié)機(jī)制。也有可能Nrf2或者NF-κB的蛋白活性而不是它們的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)Q定了下游基因的誘導(dǎo)表達(dá)。在后續(xù)的研究過(guò)程中，我們將進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假設(shè)。

總之，當(dāng)前的研究結(jié)果表明，急性Cd暴露誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)肝臟和卵巢氧化應(yīng)激和免疫毒性，而LDB預(yù)暴露可以起到緩解作用。這個(gè)過(guò)程可能涉及Nrf2和NF-κB信號(hào)通路及其誘導(dǎo)的下游基因表達(dá)和相關(guān)酶的活性。當(dāng)前的研究將為處理環(huán)境因子導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)的毒性提供新的預(yù)防措施，為促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的健康養(yǎng)殖提供新的思路和理論依據(jù)。

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