屈聰玲，樊娟，賀榆婷，楊致榮，王興春,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801)

谷子(SetariaitalicaL.)原產(chǎn)于我國，是禾本科狗尾草屬一年生疏叢型草本植物，與玉米、高粱、甘蔗、珍珠粟、糜子和柳枝稷等禾谷類糧食和能源作物近緣。谷子基因組較小，且具有抗旱、耐瘠薄和高光效等突出優(yōu)勢，是極具發(fā)展?jié)摿Φ腃4旱生禾谷類模式植物[1～5]。然而，谷子離體再生效率和遺傳轉(zhuǎn)化效率均極低，遠(yuǎn)未達(dá)到模式植物擬南芥和水稻的水平，這已經(jīng)成為制約谷子功能基因研究和轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)的瓶頸[6]。

日本學(xué)者Ben 等[7]率先開展了谷子組織培養(yǎng)的研究，利用四分體到單核小孢子期的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，成功地誘導(dǎo)出愈傷組織并再生植株。此后，以谷子幼穗、成熟胚和莖尖等材料作為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)也獲得了成功[8～10]。在國內(nèi)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的刁現(xiàn)民研究員和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的于靜娟教授等的實(shí)驗(yàn)室以及本團(tuán)隊(duì)也開展了谷子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的研究[11, 12]。但截至目前，仍局限于極少數(shù)品種，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的名優(yōu)谷子晉谷21以及測序品種豫谷1號離體再生仍較困難，限制了其基因功能的研究。

植物離體再生的過程實(shí)質(zhì)上是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵基因被激活或關(guān)閉的過程，這些基因包括WUSCHEL(WUS)、PLANTGROWTHACTIVITOR37 (PGA37)、LEAFYCOTYLEDON1 (LEC1)和LEC2等[13～15]。其中最重要、功能研究最清楚的是WUS基因。該基因編碼一個轉(zhuǎn)錄因子，與HAIRY MERISTEM(HAM)家族的4個轉(zhuǎn)錄激活子形成一個復(fù)合體，而WUS-HAM復(fù)合體與CLAVATA(CLV)形成一個反饋調(diào)節(jié)環(huán)決定著莖頂端分生組織干細(xì)胞的命運(yùn)[16, 17]。擬南芥WUS基因能夠促進(jìn)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，其功能獲得性突變體pga6的根外植體能夠再生出大量體細(xì)胞胚胎，并且這些體細(xì)胞胚胎的形成不依賴于外源植物激素[13]。與谷子類似，黃燈籠椒也是一種難以離體再生的植物，遺傳轉(zhuǎn)化困難。為解決這一難題，Solís-Ramos 等[18]將擬南芥WUS基因?qū)朦S燈籠椒中，從而大大提高了黃燈籠椒的離體再生效率。類似的，在煙草和咖啡等植物中過量表達(dá)WUS基因也可以顯著提高離體再生效率，促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生[19, 20]。2016年，杜邦先鋒等公司的研究人員發(fā)現(xiàn)玉米WUS2基因和BABYBOOM(BBM)基因?qū)﹄x體再生效率和轉(zhuǎn)化效率影響極大，將其超量表達(dá)后可以使轉(zhuǎn)化效率低的玉米品種的轉(zhuǎn)化效率從不到2%提高到51.7%[21]。最近，Mookkan 等[22]成功地利用WUS2和BBM基因建立了玉米自交系B73和大豆栽培種P898012的高效無標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該研究將極大地加快玉米和大豆功能基因組研究和轉(zhuǎn)基因品種開發(fā)的步伐。

雖然谷子離體再生困難導(dǎo)致其遺傳轉(zhuǎn)化效率極低，但谷子SiWUS基因功能尚缺乏深入研究。本文從谷子中克隆了SiWUS基因，并將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中，結(jié)果表明谷子SiWUS可以促進(jìn)擬南芥體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生大量體細(xì)胞胚胎，從而大大提高擬南芥離體再生效率。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本研究所用的谷子為豫谷1號，擬南芥(Arabidopsisthaliana) 為Columbia 野生型(Col)，擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化采用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101。以上材料均為本實(shí)驗(yàn)室保存。pER8載體由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所左建儒研究員饋贈[23]。Murashige and Skoog(MS)培養(yǎng)基購自PhytoTechnology Laboratories公司，貨號M519。17-β-雌二醇購自Sigma-Aldrich公司，貨號E-8875。KOD-Plus neo高保真DNA聚合酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，貨號KOD-401。

1.2 基因組DNA的提取

谷子基因組DNA提取參照Edwards等的SDS裂解法進(jìn)行[24]，并稍加修改：取50 mg豫谷1號幼嫩葉片加入500 μL DNA提取液(200 mmol·L-1Tris-Cl (pH 7.5)，250 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1EDTA和0.5% SDS)，利用高通量組織研磨儀(寧波新芝，型號SCIENTZ-48)充分研磨，加入l00 μL氯仿:異戊醇(24∶1)抽提以去除蛋白，上清液加入等體積異丙醇沉淀DNA。

1.3 WUS基因生物信息學(xué)分析

谷子和擬南芥WUS氨基酸序列比對分析利用ClustalW的方法進(jìn)行；WUS系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用MEGA7.0軟件的鄰位相連法進(jìn)行，所有參數(shù)均選擇默認(rèn)值，分析結(jié)果拷貝到Photoshop進(jìn)行編輯。

1.4 谷子SiWUS基因的克隆和pER8-SiWUS誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

首先在TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org)搜索擬南芥AtWUS基因(AT2G17950)，獲得其蛋白質(zhì)序列，以此為基礎(chǔ)利用Blast在Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/)進(jìn)行序列比對，獲得谷子SiWUS基因(Seita.3G027800)的信息。根據(jù)谷子SiWUS基因組序列設(shè)計引物SiWUSF: actctcgagATCACAGCCACACAGCC和SiWUSB：ggactagtATGACTTCTACTTTCACCAG，用于SiWUS基因的克隆。以豫谷1號基因組DNA為模板，利用KOD-Plus neo以及引物SiWUSF和SiWUSB擴(kuò)增SiWUS基因。PCR產(chǎn)物利用XhoI和SpeI雙酶切，連接到同樣酶切的pER8載體，構(gòu)建成谷子SiWUS誘導(dǎo)表達(dá)載體pER8-SiWUS。構(gòu)建的載體經(jīng)酶切驗(yàn)證和測序，正確的用于擬南芥轉(zhuǎn)基因。

1.5 擬南芥轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選

擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法[25]，并稍加改進(jìn)：轉(zhuǎn)化了pER8-SiWUS載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600值為1.2～1.6左右，離心后利用適量侵染液(5%蔗糖，50 μL·L-1Silwet L-77，2.03 g·L-1MgCl2)重懸；利用1 mL移液器將菌液滴在擬南芥花蕾上，覆蓋保鮮膜后黑暗培養(yǎng)12 h，正常培養(yǎng)至收獲。收獲的擬南芥種子播種在含有20 mg·L-1潮霉素B和50 mg·L-1頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗。

1.6 SiWUS過量表達(dá)擬南芥表型分析

SiWUS擬南芥轉(zhuǎn)基因種子播種在含有0和10 μmol·L-117-β雌二醇的MS培養(yǎng)基(PhytoTechnology LaboratoriesTM, 貨號M519，培養(yǎng)基中不含任何植物激素，僅添加20 g·L-1蔗糖和8 g·L-1的瓊脂粉，pH 5.8。播種后置于4 ℃春化2 d，然后放在擬南芥培養(yǎng)間培養(yǎng)。培養(yǎng)間溫度22 ℃，16 h光照/8 h黑暗。2周后，剪取無誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片和根，置于含有10 μmol·L-117-β-雌二醇的MS培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分同上)，繼續(xù)培養(yǎng)3周，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子SiWUS基因的克隆和序列分析

為了獲得谷子SiWUS的基因序列，我們以擬南芥AtWUS(AT2G17950)蛋白序列為基礎(chǔ)，在Phytozome網(wǎng)站與谷子蛋白序列進(jìn)行比對分析，共發(fā)現(xiàn)19個谷子同源基因。與擬南芥AtWUS類似，這19個谷子WUS都包含1個同源異型盒結(jié)構(gòu)域。其中，Seita.3G027800基因編碼的蛋白與擬南芥AtWUS一致性最高，全蛋白一致性為23.69%，同源異型盒結(jié)構(gòu)域一致性為75.76%，因此將該基因命名為SiWUS(圖1)。SiWUS基因全長(不包括啟動子)2 161 bp，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子，編碼325個氨基酸殘基，比擬南芥AtWUS多了33個氨基酸殘基。

2.2 谷子SiWUS的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步了解谷子SiWUS的遺傳進(jìn)化情況，從Phytozome檢索并下載了大豆(Glycinemax)、二倍體棉花(Gossypiumraimondii)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、高粱(Sorghumbicolor)、狗尾草(Setariaviridis)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、可可(Theobromacacao)、柳枝薊(Panicumvirgatum)、毛果楊(Populustrichocarpa)、葡萄(Vitisvinifera)、水稻OsWUS基因(Oryzasativa)、西紅柿(Solanumlycopersicum)和玉米(Zeamays)等13個物種的WUS蛋白序列，與上述擬南芥和谷子的WUS序列一起利用MEGA7.0構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2所示，所有選擇植物的WUS蛋白形成兩個大的分枝：單子葉植物分枝和雙子葉植物分枝。谷子WUS與狗尾草WUS親緣關(guān)系最近，蛋白序列一致性為99.69%，這與目前普遍認(rèn)為的狗尾草是谷子的近緣野生種這一觀點(diǎn)是相符的。這15種植物的WUS基因結(jié)構(gòu)相似，均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子(圖2)。

2.3 谷子SiWUS基因克隆和誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

利用引物SiWUSF和SiWUSB，以豫谷1號基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增谷子SiWUS基因。擴(kuò)增片段長度1 407 bp，該擴(kuò)增片段包括SiWUS基因的ORF、78 bp 的5'-UTR、113 bp的3'-UTR以及XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)(圖3 A)。對該條帶進(jìn)行測序分析表明，該條帶序列與參考基因組豫谷1號序列一致。為了避免由于谷子SiWUS基因過量表達(dá)而影響植物正常生長發(fā)育，導(dǎo)致最終無法獲得轉(zhuǎn)基因種子，將SiWUS基因克隆到雌激素誘導(dǎo)表達(dá)載體pER8上，構(gòu)建成pER8-SiWUS載體(圖3B)。將該載體轉(zhuǎn)化擬南芥，共獲得了14個株系的pER8-SiWUS轉(zhuǎn)基因陽性植株，所有轉(zhuǎn)基因株系呈現(xiàn)類似的表型。無特殊說明，后續(xù)試驗(yàn)均采用12號株系進(jìn)行。

圖1 谷子SiWUS與擬南芥AtWUS氨基酸序列比對方框中的氨基酸為同源異型盒結(jié)構(gòu)域Fig.1 Amino acid sequence alignment of Setaria italica SiWUS with Arabidopsis AtWUS The amino acid in the box is the homeobox domain

圖2 15 種植物WUS蛋白進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The unrooted phylogenetic tree and gene structure of WUS in 15 plant species

2.4 過量表達(dá)谷子SiWUS基因促進(jìn)了擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生

圖3 SiWUS基因的PCR擴(kuò)增和誘導(dǎo)表達(dá)載體T-DNAFig.3 PCR amplification of the SiWUS gene and the T-DNA structure of the inducible vector 注：A：SiWUS基因的PCR擴(kuò)增，M：D2000 DNA 分子量標(biāo)記(天根生化科技(北京)有限公司，#MD114)。B：SiWUS基因誘導(dǎo)表達(dá)載體T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖。RB：右邊界；PG10-90：一個合成的啟動子；XVE：一個嵌合的轉(zhuǎn)錄激活子，它由細(xì)菌抑制子LexA (X)、VP16 (V)的酸性反式激活域和人雌激素受體(E，ER)的調(diào)控區(qū)組成。TE9：rbcS E9終止子；PNOS: NOS啟動子；HPT：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；TNOS：NOS終止子；OLexA：LexA操縱子；T3 A：rbcs3A 終止子；LB：左邊界。 Note：A：PCR amplification of SiWUS gene. M: D2000 DNA Marker (Tiangen Biotech (Beijing) Co. LTD, #MD114). B：The T-DNA structure of the SiWUS inducible vector. RB: right board; PG10-90: a synthetic promoter; XVE is a chimeric transcription activator which is assembled by fusion of the DNA-binding domain of the bacterial repressor LexA (X), the acidic trans-activating domain of VP16 (V) and the regulatory region of human estrogen receptor (E, ER). TE9：rbcS E9 terminator; PNOS: NOS promoter; HPT: hygromycin phosphotransferase; TNOS: NOS terminator; OLexA: LexA operator; LB: left board.

為了深入了解谷子SiWUS基因在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的功能，分別剪取pER8-SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的根和葉片，置于含有10 μmol·L-117-β-雌二醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。3周后，谷子SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的根部長出大量體細(xì)胞胚胎，而未轉(zhuǎn)基因的對照卻無體細(xì)胞胚胎產(chǎn)生(圖4 A)。類似的，SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片基部也長出大量體細(xì)胞胚胎，而未轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~片已經(jīng)完全死亡(圖4B)。這些結(jié)果表明，過量表達(dá)谷子SiWUS基因可以促進(jìn)離體器官的體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并再生出體細(xì)胞胚胎。

圖4 SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥根和葉的體細(xì)胞胚胎Fig.4 Somatic embryos on the roots and leaves of SiWUS transgenic Arabidopsis 注：A：在無(左)和含10 μmol·L-1 17-β雌二醇(右)的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥根外植體。B：在無(左)和含10 μmol·L-1 17-β雌二醇(右)的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥葉外植體。標(biāo)尺：1 mm。 Note：A：Root explants of SiWUS transgenic Arabidopsis cultured on MS medium without (left) or with 10 μmol·L -1(right) 17-β estradiol for 3 weeks. B： Root explants of SiWUS transgenic Arabidopsis cultured on MS medium without (left) or with 10 μmol·L-1 17-β estradiol (right) for 3 weeks. Bar: 1 mm.

2.5 過量表達(dá)谷子SiWUS基因抑制了擬南芥幼苗的發(fā)育

在擬南芥中過量表達(dá)谷子SiWUS基因可以使離體根和葉片再生出體細(xì)胞胚胎，表明SiWUS基因在體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程中起著重要的作用。然而，這些結(jié)果是在離體條件下獲得的。為了更深入地了解SiWUS基因在植物生長和發(fā)育過程的功能，我們將SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別播種在含有0和10 μmol·L-117-β-雌二醇的MS培養(yǎng)基上。在不含雌二醇的培養(yǎng)基上，SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥生長完全正常，無異常表型(圖5 A)。然而，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥變體生長嚴(yán)重受阻，植株矮小，根部不能伸長(圖5B)。一些幼苗根部甚至出現(xiàn)了大量體細(xì)胞胚胎(圖5C和D)。

圖5 SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗Fig.5 Seedlings of SiWUS transgenic Arabidopsis 注：A：在無17-β雌二醇的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)10 d后的SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗。B：含10 μmol·L-117-β雌二醇的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)10 d后的SiWUS轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗。C：圖A和圖B中的單株幼苗。D：體視鏡拍攝的圖C中誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的幼苗。標(biāo)尺：A和B 為1 cm，C 為5 mm，D 為1 mm。 Note：A:10 days seedlings of SiWUS transgenic seedlings cultured on MS medium without 17-β estradiol. B:10 days seedlings of SiWUS transgenic seedlings cultured on MS medium with 10 μmol·L-1 17-β estradiol. C: Single seedlings from Panel A and B. D:Seedlings cultured on inducible medium in Panel C taken with a stereomicroscope. Bar: A and B 1 cm, C 5 mm, D 1 mm.

3 討論與結(jié)論

WUS基因在植物離體再生過程起著重要的作用，該基因過量表達(dá)可以提高多種植物的離體再生效率和遺傳轉(zhuǎn)化效率[13, 18～22]。本文從谷子中克隆了一個SiWUS基因，并深入研究了該基因在植物生長發(fā)育和體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的功能，為SiWUS基因在谷子離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

從谷子中鑒定了19個WUS基因，與狗尾草中的WUS基因數(shù)目相同，但少于擬南芥(25個)、高粱(23個)和玉米(44個)等。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，15種植物WUS蛋白分成單子葉植物和雙子葉植物兩大分枝。由于在基因分化過程中，突變積累的數(shù)目與進(jìn)化時間成正比，據(jù)此推斷植物WUS基因可能出現(xiàn)在單雙子葉分化之前。這可能也是導(dǎo)致單子葉谷子SiWUS蛋白與雙子葉植物擬南芥AtWUS蛋白一致性較低的原因。

谷子SiWUS與擬南芥AtWUS同源異形盒結(jié)構(gòu)域的一致性較高，為75.76%；但整個蛋白的一致性僅僅為23.69%(圖1)。盡管如此，在擬南芥中過量表達(dá)谷子SiWUS基因與過量表達(dá)擬南芥AtWUS基因表型類似：幼苗生長發(fā)育受阻，根不能伸長(圖5)[13]。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)10 d的轉(zhuǎn)SiWUS基因擬南芥根部長出體細(xì)胞胚胎(圖5)，而同樣處理的轉(zhuǎn)AtWUS基因擬南芥根部未見明顯體細(xì)胞胚胎形成[13]，這可能是由兩個轉(zhuǎn)基因擬南芥中WUS基因表達(dá)量不同導(dǎo)致的。此外，在擬南芥中過量表達(dá)谷子SiWUS基因?qū)е麦w細(xì)胞向

胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，最終促使離體培養(yǎng)的根和葉片產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎(圖4)。因此，SiWUS基因過量表達(dá)有望提高谷子的離體再生效率和遺傳轉(zhuǎn)化效率，從根本上解決目前谷子離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化困難的問題。因此，下一步我們計劃將SiWUS基因轉(zhuǎn)到晉谷21和豫谷1號等核心谷子種質(zhì)資源中，將這些難于再生的谷子品種打造成易于再生和遺傳轉(zhuǎn)化的品種。谷子基因組中至少有19個WUS基因，本文僅對SiWUS基因的功能進(jìn)行了研究，其余18個谷子WUS基因是否也具有類似功能還有待進(jìn)一步研究。

本研究從谷子中克隆了一個SiWUS基因，并將其在擬南芥中過量表達(dá)，通過對幼苗表型分析以及離體根和葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生情況分析，揭示了該基因在植物生長發(fā)育和體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的功能。過量表達(dá)SiWUS基因可促進(jìn)植物體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生大量體細(xì)胞胚胎。因此，谷子SiWUS基因有望應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，通過提高離體再生效率，進(jìn)而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。本研究為解決谷子遺傳轉(zhuǎn)化困難，提高轉(zhuǎn)化效率，開辟了一條新思路。

附：WUS基因編號

大豆GmWUS(Glyma.01G166800)、二倍體棉花GrWUS(Gorai.008G063200)、二穗短柄草BdWUS基因(Bradi5g25113)、高粱SbWUS基因(Sobic.006G254900)、狗尾草SvWUS基因(Sevir.3G028500)、谷子SiWUS基因(Seita.3G027800)、蒺藜苜蓿MtWUS基因(Medtr5g021930)、可可TcWUS基因(Thecc1EG000215t1)、柳枝薊PvWUS基因(Pavir.Gb00125)、毛果楊PtWUS(Potri.005G114700)、擬南芥AtWUS基因(AT2G17950)、葡萄VvWUS基因(GSVIVT01018787001)、水稻OsWUS基因(LOC_Os04g56780)、西紅柿SlWUS(Solyc02g083950.2)玉米ZmWUS基因(GRMZM2G047448)。

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