薛金愛，高慧玲，高宇，郝青婷，劉寶玲，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

中國是世界上棉花單產(chǎn)量最高的國家。但是，由于棉花產(chǎn)量大，生產(chǎn)成本低，相關(guān)棉織產(chǎn)品價格低廉，棉花經(jīng)濟(jì)效益不高。如何穩(wěn)定高效的提高棉花的經(jīng)濟(jì)效益，已成為目前我國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。棉籽是棉花作物的種籽，是植物油脂的重要來源，因此提高棉籽油利用率對于穩(wěn)定發(fā)展棉花產(chǎn)業(yè)起著重要的作用[1]。

目前已有許多學(xué)者對棉籽油脂肪酸生物功能進(jìn)行了研究，一些脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸如油酸和亞油酸成為了高值物質(zhì)。關(guān)于脂肪酸生物合成的代謝途徑及其調(diào)控也受到廣泛的關(guān)注[2]。棉籽油脂肪酸合成途徑受到多種酶的調(diào)控，其中β-酮脂酰-ACP合成酶II (KASII)催化16碳酸延長至18碳酸；Δ9硬脂酰-ACP脫氫酶(SAD)催化硬脂酸(18∶0)轉(zhuǎn)化為油酸(18∶1)；Δ12脂肪酸脫氫酶(FAD2)催化油酸 (18∶1) 轉(zhuǎn)化為亞油酸 (18∶2)；二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶 (DGAT2) 是催化三酰甘油(TAG)生物合成的最后一步。這些相關(guān)酶對棉籽油脂肪酸的組成和含量起了決定性作用。因此，明確棉花油脂代謝過程的一些相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，對利用油脂代謝工程定向改造棉籽油成分、含量、棉花育種及棉花綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

棉籽油脂中相對含量較多的3種脂肪酸是棕櫚酸(16∶0)、油酸(18∶1)和亞油酸(18∶2)，油酸和亞油酸這兩種不飽和脂肪酸的含量接近80%，其中亞油酸(18∶2)含量最高，可高達(dá)50%以上[3～5]。棉籽油由于富含不飽和脂肪酸，尤其是亞油酸屬于高值脂肪酸，可用于生產(chǎn)特殊用途的食用油，比如高亞油酸保健油等[6]。因此明確棉籽油脂肪酸的組成和含量對于提高棉花的營養(yǎng)價值以及培育專用型油脂品種的選育提供一定的理論依據(jù)。雖然目前已有關(guān)于棉花脂肪酸組成的報道[7～9]，但是關(guān)于對3種栽培棉進(jìn)行比較分析的報道很少。為此，本文以3種栽培棉海島棉(G.barbadense)、亞洲棉(G.arboretumL.)和3種陸地棉(G.hirsutum)為試驗材料，提取棉籽油進(jìn)行粗脂肪定量，使用氣相色譜分析(GC)對棉籽油中的脂肪酸組成和含量進(jìn)行分析，并利用qRT-PCR技術(shù)分析4個相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，以期解析3種栽培棉籽油脂肪酸組成差異的分子遺傳基礎(chǔ)，旨在為培育棉籽油專用型品種以及提高棉花綜合利用價值提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

材料：海島棉pima379、亞洲棉石系亞1號和陸地棉(徐19、冀豐1271、中棉所2)，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗基地。

主要試劑:氯仿∶甲醇(2∶1)、0.9% KCL、甲醇鈉、異辛烷、RNA提取試劑盒等。

1.2 主要儀器與設(shè)備

氣相色譜儀(美國安捷倫7890B)、搖床、離心機(jī)、氮吹儀、PCR儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 棉花種子的收集

選用種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗基地的棉花材料，在授粉棉鈴25 d后，取胚珠液氮速凍后保存于-80 ℃，用于表達(dá)試驗；并收獲其種子用于油脂提取。每種材料選用3粒飽滿的種子，以備重復(fù)實驗。

1.3.2 棉籽油脂的提取以及含油量的測定

分別稱取50 mg充分研磨的去殼干種子粉末于離心管中，加入甲醇∶氯仿(2∶1)溶液，搖床抽提24 h，離心后收集上層有機(jī)相，加入氯仿、NaCl溶液，離心10 min，收集下層有機(jī)相到稱重的玻璃管中，氮氣吹干后稱出玻璃管及脂肪酸的總重量。計算方法：

總脂含量=(提取后總重-提取前管重)/0.05。

1.3.3 棉籽油脂的甲酯化

將提取的棉籽油甲酯化，先加入甲醇鈉，混勻后震動20～45 min。然后加入異辛烷，混勻、離心、靜置使溶液分層。最后加入0.9% KCL, 混勻，離心至溶液分層，用玻璃吸管吸取上層(含脂肪酸甲酯FAME)溶液，放入GC小瓶中編號，放入-20 ℃冰箱保存待測。

1.3.4 棉籽油脂肪酸成分的測定

將甲酯化后的樣品用氣相色譜儀進(jìn)行分析測定，參數(shù)條件為：進(jìn)樣口溫度為260 ℃，高純氮氣作為載氣；檢測器溫度250 ℃；色譜柱型號：HP-88(100 m*0.25 mm*0.2 μm)。利用17種混標(biāo)中各脂肪酸甲酯(FAME)保留時間的對比確定樣品中FAME的種類，利用峰面積歸一化法確定各FAME相對含量，計算方法為：某一種FAME相對含量=(某一FAME的峰面積/總FAME的峰面積)×100%。

1.3.5 相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

1.3.5.1 序列查找及保守區(qū)同源引物的設(shè)計

在Cottongen數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)中blast搜索找到海島棉、亞洲棉和陸地棉的FAD2、KASII、DGAT2、SAD對應(yīng)的CDS序列，然后在開放閱讀框內(nèi)經(jīng)比對分析，找到對應(yīng)的保守區(qū)，利用Primer primer5.0軟件設(shè)計引物用于qPCR反應(yīng)(表1)。

表1 試驗所用引物Table 1 The primers of present experiment

1.3.5.2 棉花胚珠總RNA的提取和cDNA的合成

采用北京康潤(Genstar)公司的Plant RNA Kit試劑盒提取棉花25 d胚珠總RNA，具體試驗方法參照試劑盒說明書，采用Genstar(康潤公司，北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3.5.3 qRT-PCR驗證基因的表達(dá)

以陸地棉GhEF-1α，海島棉GbUBQ7作為內(nèi)參，并用qPCRsoft3.0(2-ΔΔCq)對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，Origin 6.0繪制柱形圖。反應(yīng)體系參考Takara公司試劑盒說明書推薦的20 μL體系，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變形30 s，58 ℃退火15 s，40個循環(huán)，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種棉籽油的含油量的分析

經(jīng)分析，5種棉籽油材料的含油量均可達(dá)到30%以上，最高的為陸地棉冀豐1271，可達(dá)40.18%，最低的為海島棉pima379，含量為35.66%。(表2)。

表2 5種栽培棉棉籽油含油量Table 2 The Oil contents of five kinds of cotton seeds

2.2 5種棉籽油的FAME 組成以及含量的分析

由氣相色譜分析得知(圖1)，5種棉籽油脂肪酸甲酯(FAME)主要集中在C16∶0(棕櫚酸)、C18∶0(硬脂酸)、C18∶1(油酸)、C18∶2(亞油酸)。經(jīng)計算分析得到5種栽培棉棉籽FAME的組成和含量(表3)，由表可見，5種材料脂肪酸甲酯總含量不存在顯著差異。其中飽和脂肪酸主要集中在C16∶0，含量在21%～25%之間，而不飽和脂肪酸主要是C18∶1、C18∶2，二者總含量可以達(dá)到70%以上，尤其是C18∶2的含量最高，與C16∶0、C18∶0、C18∶1的含量存在顯著差異。

每種棉籽油的FAME組成在相對含量上也有一定的差異，陸地棉徐19的C16∶0含量最高，陸地棉中植棉2最高值則是C18∶2，而海島棉pima379在C18∶0達(dá)最高值，亞洲棉石系亞1號中含量最高的是C18∶1，可達(dá)33.46%，是其它4種材料含量的二倍，由于其C18∶1含量高，所以導(dǎo)致其C18∶2的含量比海島棉和陸地棉的都低。

2.3 棉籽油代謝途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

經(jīng)qRT-PCR分析(圖2)5種棉籽油材料油脂代謝途徑4種相關(guān)酶基因在棉籽胚珠中都有一定的表達(dá)，但各酶基因表達(dá)量有一定的差異。

圖1 5種棉籽油材料的GC圖譜Fig.1 Gas chromatograms of five kinds of cotton seeds

脂肪酸甲酯FAME海島棉pima379Gb．pima379亞洲棉石系亞1號Ga．shixiya1徐19Xu19冀豐1271Jifeng1271中植棉2號CCRI2平均含量AveragecontentC16∶0238321712447220921162265bC18∶0320248211228214244cC18∶1194333461679155515932023bC18∶2535442615664600860775473a

注：不同字母代表p<0.05差異顯著

Note: Different letters represent significant at 0.05 level.

圖2 5種棉籽油4個油脂代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)分析Fig.2 The expression and analysis of four oil metabolism related enzyme genes in five cotton seed oil

5種材料中FAD2的表達(dá)量均是最高，其余3個酶基因的表達(dá)存在一定的差異。中植棉2號SAD的表達(dá)量最低，其它4種材料是KASII的表達(dá)量最低，表達(dá)量僅是FAD2的1/3。海島棉pima379、中植棉2號、冀豐1271和徐19中DGAT2的表達(dá)量僅次于FAD2的表達(dá)量，而亞洲棉石系亞1號中SAD的表達(dá)量次于FAD2，DGAT2的表達(dá)量低于FAD2和SAD。

3 結(jié)論與討論

棉籽油脂既是食用油的主要來源,又是重要的工業(yè)原料，因而具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[10]。棉籽油脂肪酸成分包括飽和脂肪酸類和不飽和脂肪酸類；飽和脂肪酸類包括棕櫚酸和硬脂酸；不飽和脂肪酸類包含油酸和亞油酸。棉籽脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，2種主要不飽和脂肪酸占棉籽總脂肪酸含量的70%以上，亞油酸是占比最大的脂肪酸[11]。本文對棉籽脂肪酸成分分析結(jié)果顯示，3種栽培棉中陸地棉材料的含油量相對高于其它2種，這與前人研究結(jié)果一致。目前，我國陸地棉栽培面積比例可達(dá)90%以上[12,13]。而棉籽油脂的經(jīng)濟(jì)價值及用途的決定因素是其脂肪酸組成和含量。大多數(shù)研究人員對亞油酸的關(guān)注更高。本文通過對棉籽油脂肪酸成分分析發(fā)現(xiàn)了另一個值得關(guān)注的脂肪酸——棕櫚酸，棉籽油飽和脂肪酸棕櫚酸(16∶0)的含量可高達(dá)20%以上，遠(yuǎn)高于另一種飽和脂肪酸硬脂酸(18∶0)，而且也高于大豆等其它油料作物。如將其部分甚至全部轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(16∶1)，將為生產(chǎn)生物柴油提供最佳的生產(chǎn)原料，這樣不僅可以充分提高棉籽油的工業(yè)價值，同時也為培育專用型

棉花品種指明了方向，為穩(wěn)定而高效發(fā)展棉花產(chǎn)業(yè)做出貢獻(xiàn)。

本文在前人對脂肪酸代謝途徑相關(guān)研究的基礎(chǔ)上[2],進(jìn)一步對棉籽油脂肪酸代謝相關(guān)酶基因進(jìn)行組織表達(dá)分析,可以進(jìn)一步闡明棉籽油脂肪酸代謝的分子遺傳基礎(chǔ)，而且對利用代謝工程組裝技術(shù)改善棉花種子中脂肪酸的組分和品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。棉籽油脂肪酸組成和含量取決于脂肪酸代謝途徑的一些相關(guān)酶的表達(dá)情況。FAD2催化油酸(18∶1)轉(zhuǎn)化為亞油酸(18∶2)，本文獲得結(jié)果表明5種材料均是FAD2的表達(dá)量相對高一些，這是對棉籽油富含不飽和脂肪酸尤其是亞油酸(18∶2)的一個很好的詮釋。3種陸地棉材料均是DGAT2的表達(dá)量較低于FAD2的表達(dá)量，海島棉和亞洲棉材料DGAT2的表達(dá)量相對低一些。這與海島棉和亞洲棉這2種材料含油量相對比較低是符合的。亞洲棉則是SAD的表達(dá)量較低于FAD2的表達(dá)量，SAD催化硬脂酸(18∶0)轉(zhuǎn)化為油酸(18∶1)，亞洲棉籽中油酸(18∶1)的含量最高，最接近亞油酸(18∶2)的含量。5種材料中除了陸地棉中植棉2，其余的KASII的表達(dá)量均是處于最低水平，KASII催化16碳酸延長至18碳酸，因此硬脂酸(18∶0)的含量也屬于最低。本研究對棉籽油脂肪酸組成的分子遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了驗證，結(jié)果可為棉籽油的營養(yǎng)價值、工業(yè)價值的深度利用以及提高棉花綜合利用價值提供理論依據(jù)及參考信息。

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