張瑞娟，屈聰玲，賀榆婷，楊致榮，王興春,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801)

氮素是作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程需求量最大的營(yíng)養(yǎng)元素，也是限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。然而，當(dāng)前我國(guó)氮肥的平均利用率僅35%左右[1]。低水平的氮肥利用率不僅造成了資源的大量浪費(fèi)，而且還帶來(lái)了土壤酸化、水體富營(yíng)養(yǎng)化等一系列環(huán)境問(wèn)題[2, 3]。因此，充分挖掘利用作物自身潛力，提高氮素利用效率是發(fā)展資源節(jié)約型和環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)的重要保障。

對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，硝態(tài)氮是植物從土壤中吸收和利用的主要氮源，其吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成[4, 5]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(nitrate transporter 1，NRT1)家族是植物中最大的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。該家族蛋白不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)鉀鹽、多肽、氨基酸、葡萄糖異硫氰酸鹽和植物激素等，因此也有人將NRT1家族稱之為NPF家族(NRT1/PTR FAMILY)[6, 7]。在模式植物擬南芥中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)53個(gè)NRT1家族成員[8]。其中，已知的與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白有11個(gè)，它們各司其職，共同促進(jìn)植物對(duì)氮素的吸收利用[4]。AtNRT1.1(AtNPF6.3)是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的NRT1家族蛋白，參與高、低濃度硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[9, 10]。AtNRT1.1與另外一個(gè)NRT1家族蛋白AtNRT1.2共同負(fù)責(zé)根部硝酸鹽吸收[10, 11]。根部吸收的硝酸鹽，由AtNRT1.5、AtNRT1.8和AtNRT1.9進(jìn)一步運(yùn)輸至植物的莖部[12～14]。AtNRT1.4和AtNRT1.6基因分別在葉柄和幼嫩的種子中表達(dá)，負(fù)責(zé)調(diào)控硝酸鹽向葉片和種子的分配，在調(diào)控葉片和胚胎早期發(fā)育過(guò)程起著重要的作用[15, 16]。在擬南芥衰老過(guò)程中，AtNRT1.7基因負(fù)責(zé)硝酸鹽從衰老器官向幼嫩器官的轉(zhuǎn)運(yùn)，該基因功能喪失后將影響植物氮素的循環(huán)再利用[17]。AtNRT1.11和AtNRT1.12 在主葉脈的伴胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)硝酸鹽從木質(zhì)部到韌皮部的轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。此外，AtNRT1.3基因在地上部分的表達(dá)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，但在硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的具體功能尚不清楚[19]。與擬南芥相比，水稻中NRT1基因家族的研究相對(duì)較少。其中，功能較清楚的是AtNRT1.1的同源基因OsNRT1.1B[20]。正是由于NRT1.1B基因一個(gè)單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致了秈稻和粳稻兩大亞種之間硝酸鹽利用的差異，該基因在提高水稻氮素利用效率方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[20]。

谷子具有突出的耐瘠薄特性，是解析作物氮素高效吸收利用機(jī)制的理想材料。2012年，由中國(guó)華大基因和美國(guó)國(guó)家能源部所屬的聯(lián)合基因組研究所分別進(jìn)行的張谷和豫谷1號(hào)全基因組測(cè)序工作相繼完成，使得在全基因組水平鑒定谷子氮素高效利用相關(guān)基因成為可能[21, 22]。前期我們利用生物信息學(xué)的方法從谷子中鑒定了93個(gè)NPF家族蛋白，但這些蛋白中可能僅有少部分參與了硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)(王興春，未發(fā)表數(shù)據(jù))。本文進(jìn)一步以擬南芥中11個(gè)具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能的NRT1家族蛋白為基礎(chǔ)，從谷子中鑒定出8個(gè)可能與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的NRT1基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)譜分析，為深入揭示硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1家族基因功能和谷子耐貧瘠的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子NRT1基因表達(dá)模式分析所用品種為‘豫谷1號(hào)’。將‘豫谷1號(hào)’播種在大田，2周后取長(zhǎng)勢(shì)良好且健康的幼苗；抽穗5天時(shí)，分別取長(zhǎng)勢(shì)良好且健康植株的根、莖、葉和穗。所有材料均取3份生物學(xué)重復(fù)，取材后立即液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 擬南芥、水稻和谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1家族的篩選

目前，擬南芥中已知的與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的NRT1基因有11個(gè)，分別為AtNRT1.1-AtNRT1.9，AtNRT11和AtNRT12。首先，在TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)檢索這11個(gè)NRT1的蛋白序列，若該基因有不同剪切方式，則選擇最長(zhǎng)的一個(gè)。然后，將獲得的蛋白序列在Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/)分別與谷子和水稻基因組進(jìn)行序列比對(duì)，從而獲得谷子和水稻NRT1家族的CDS序列、基因全長(zhǎng)、啟動(dòng)子序列及氨基酸序列。

1.3 NRT1家族生物信息學(xué)分析

利用ExPASy(https://www.expasy.org/)的computer pI/Mw工具在線分析谷子、擬南芥和水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1的理化性質(zhì)，所有參數(shù)均選擇默認(rèn)。用Mega 7.0軟件[23]對(duì)谷子、擬南芥和水稻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neibor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析參數(shù)選擇默認(rèn)值。以谷子全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，搜索NRT1家族成員基因序列上游的1 500 bp堿基，獲取啟動(dòng)子ATG之前的所有堿基序列作為基因的啟動(dòng)子序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析谷子NRT1家族成員啟動(dòng)子元件。通過(guò)MEME v4.11.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析谷子、擬南芥和水稻NRT1家族成員氨基酸序列保守位點(diǎn)，保守位點(diǎn)寬度設(shè)置為≥10和≤100，最大保守序列鑒定數(shù)目設(shè)置為6。

1.4 谷子總RNA的提取和RT-PCR

谷子總RNA的提取采用TaKaRa的總RNA提取試劑盒(貨號(hào)9769S)，反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa的PrimeScriptT TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(貨號(hào)RR047 A)，所有操作都嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。取苗、根、莖、葉和穗的cDNA，采用RT-PCR的方法檢測(cè)基因的表達(dá)情況，RT-PCR引物見表1。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子NRT1的鑒定

以擬南芥中11個(gè)參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的NRT1蛋白序列為基礎(chǔ)，利用 BLASTP在谷子全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，共鑒定出8個(gè)谷子NRT1基因(表1)。其中，與擬南芥AtNRT1.6和AtNRT1.7蛋白序列相似度最高的谷子NRT1家族蛋白均為Seita.5G424900，將其歸為序列相似度較高的AtNRT1.7的同源基因；與擬南芥AtNRT1.5和AtNRT1.9蛋白序列相似度最高的均為Seita.1G296400，將其歸為序列相似度較高的AtNRT1.5的同源基因；與擬南芥AtNRT1.11和AtNRT1.12蛋白序列相似度最高的均為Seita.5G326900，將其歸為序列相似度較高的AtNRT1.11的同源基因。為了比較谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1基因家族與其它單子葉植物之間的進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)從單子葉模式植物水稻中鑒定出8個(gè)與硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的NRT1基因(表2)。這些NRT1蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度在576～620 aa之間，分子量處于57.53～68.7 kDa之間，理論等電點(diǎn)在5.5～9.23之間。

2.2 谷子硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)NRT1家族系統(tǒng)發(fā)育樹和基因結(jié)構(gòu)分析

為揭示谷子中參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的NRT1家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并對(duì)其進(jìn)行分類，利用谷子、水稻和擬南芥NRT1蛋白全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。參照擬南芥NPF家族分類結(jié)果，谷子中8個(gè)參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的NRT1分屬于5個(gè)NPF亞家族，其中NPF6亞家族3個(gè)成員，NPF2亞家族2個(gè)成員，NPF1、NPF4和NPF7亞家族各有1個(gè)成員(圖1)。此外，谷子所有NRT1與水稻同一亞家族親緣關(guān)系相對(duì)較近，而與擬南芥同一亞家族成員間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖1)。對(duì)家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析顯示，與擬南芥和水稻相比，谷子NRT1基因結(jié)構(gòu)相對(duì)較簡(jiǎn)單，內(nèi)含子數(shù)較少，為1～3個(gè)。此外，同一亞家族的谷子、水稻和擬南芥NRT1基因之間內(nèi)含子數(shù)相差較大(圖1)。

表2鑒定的谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)NRT1基因及其在擬南芥和水稻中的同源基因和相應(yīng)的理化性質(zhì)

Table2NRT1 genes identified inSetariaitalicaand their homologs inArabidopsisthalianaandOryzasativaand there physical and chemical properties

擬南芥Arabidopsisthaliana水稻Oryzasativa谷子Setariaitalica符號(hào)Symbol基因編號(hào)GeneID分子量/kDMolecularWeight等電點(diǎn)Isoelectricpoint符號(hào)Symbol基因編號(hào)GeneID分子量/kDMolecularWeight等電點(diǎn)Isoelectricpoint符號(hào)Symbol基因編號(hào)GeneID分子量/kDMolecularWeight等電點(diǎn)IsoelectricpointAtNRT11At1G121106492868OsNPF65LOC＿Os10g406006372828SiNPF63Seita．6G0583006452919AtNRT12At1G698506398881OsNPF411LOC＿Os06g382946373903SiNPF415Seita．4G2315006369884AtNRT13At3G21670652591OsNPF66LOC＿Os04g390306237901SiNPF67Seita．1G2105006496923AtNRT14At2G266906357906OsNPF62LOC＿Os01g375906258855SiNPF62Seita．5G1950005753877AtNRT15At1G3245068755OsNPF711LOC＿Os02g485706411628SiNPF712Seita．1G2964006411663AtNRT16At1G270806493717--------AtNRT17At1G698706842884OsNPF25LOC＿Os01g685106579812SiNPF210Seita．5G4249006705866AtNRT18At4G216806551611------AtNRT19At1G188806517907OsNPF24LOC＿Os03g481806356908SiNPF28Seita．3G4065006481758AtNRT111At1G52190669897OsNPF12LOC＿Os01g556106456914SiNPF14Seita．5G3269006422895AtNRT112At3g161806533912--------

圖1 谷子、擬南芥和水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1家族蛋白進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)Fig.1 The unrooted phylogenetic tree and gene structure of nitrate transporter NRT1 family in Setaria italica, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.3 谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)NRT1家族蛋白保守位點(diǎn)分析

利用DNAMAN5.0和MEME在線軟件對(duì)11個(gè)擬南芥NRT1家族成員、8個(gè)水稻NRT1家族成員和8個(gè)谷子NRT1家族成員的蛋白保守位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷子參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的NRT1蛋白都含有1個(gè)由25個(gè)氨基酸組成的保守QX4GX8GX3FX5P基序(圖2)。進(jìn)一步分析表明，在擬南芥和水稻參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的NRT1蛋白中也含有1個(gè)類似基序(圖2)，這表明NRT1基因在不同物種間進(jìn)化存在保守性。

2.4 谷子NRT1基因啟動(dòng)子序列分析

分別截取8個(gè)谷子NRT1基因的起始密碼子上游1 500 bp的基因組序列，利用Plant CARE分析預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件。發(fā)現(xiàn)NRT1家族成員啟動(dòng)子除含有一些基本元件如CAAT-box、TATA-box之外，還富含光響應(yīng)元件(6種)，其中所有的基因均含有SP1、G-Box及G-box光響應(yīng)元件和TGACG-motif茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。谷子NRT1基因還含有幾種逆境相關(guān)元件和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件，如干旱響應(yīng)元件(MBS)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、分生作用相關(guān)元件(CCGTCC-box)、生長(zhǎng)素誘導(dǎo)增強(qiáng)元件(GC-motif)及水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)等。此外，5個(gè)谷子NRT1基因啟動(dòng)子含有高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件(表3)。

圖2 NRT1蛋白家族保守基序分布Fig.2 Distribution of conserved motifs of NRT1 family members

2.5 谷子NRT1家族基因表達(dá)模式分析

為了研究谷子NRT1基因家族在不同組織中的表達(dá)特征，我們利用RT-PCR的方法檢測(cè)了上述8個(gè)NRT1基因在苗、根、莖、葉和穗中的表達(dá)情況。如圖3所示，8個(gè)谷子NRT1基因表達(dá)具有組織特異性，其中Seita.1G210500和Seita.5G424900基因在檢測(cè)的所有組織中都表達(dá)，且這兩個(gè)基因在葉中的表達(dá)量都相對(duì)較高；所有8個(gè)NRT1基因在幼苗和莖中都表達(dá)，但Seita.5G195000基因的表達(dá)量相對(duì)較低；Seita.1G210500、Seita.5G424900和Seita.6G058300 3個(gè)基因在根中表達(dá)，可能負(fù)責(zé)從土壤中吸收硝酸鹽；而Seita.1G210500、Seita.3G406500和Seita.5G424900在穗中表達(dá)，可能參與了籽粒形成過(guò)程硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖3 硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)NRT1基因在谷子不同組織中的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of NRT1 genes in different foxtail millet tissues

3 討論

隨著植物基因組研究的不斷深入以及豫谷1號(hào)和張谷等谷子基因組測(cè)序工作的相繼完成，利用比較基因組學(xué)鑒定和分析谷子重要功能基因家族成為可能。本研究以模式植物擬南芥和水稻作為參照，在谷子全基因組水平鑒定了8個(gè)與硝酸鹽吸

收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的NRT1家族基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式研究，為后續(xù)深入解析谷子NRT1基因家族的功能和解析谷子氮素高效利用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于提高作物氮素利用效率、減輕環(huán)境污染和降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本等具有重要意義。

進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)谷子參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的NRT1基因分屬于NPF1、NPF2、NPF4、NPF6和NPF7亞家族，但缺少擬南芥AtNRT1.6(At1G27080)、AtNRT1.8(At4G21680)和AtNRT1.12(At3g16180)對(duì)應(yīng)的同源基因(圖1)，這與同為單子葉植物的水稻和小麥類似[24]。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能有兩個(gè)：一是谷子等單子葉植物在全基因組復(fù)制時(shí)發(fā)生未知事件造成了NRT1基因的缺失；二是單雙子葉植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，這些基因發(fā)生較大的變異。此外，谷子與水稻NRT1家族的親緣關(guān)系較近，而與擬南芥之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。NRT1基因內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目和分布情況能為其進(jìn)化關(guān)系提供重要的證據(jù)。盡管我們發(fā)現(xiàn)NRT1家族在谷子、水稻和擬南芥中具有保守的QX4GX8GX3FX5P基序(圖2)，但該基序是否與硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)仍有待深入研究。硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)受到眾多因素的影響，其中光是最重要的因素之一[25]。我們發(fā)現(xiàn)谷子NRT1基因家族啟動(dòng)子區(qū)富含6種光響應(yīng)元件，其中8個(gè)啟動(dòng)子全部含有SP1光響應(yīng)元件(表3)，這可能是光合作用的產(chǎn)物量增加導(dǎo)致氮素等營(yíng)養(yǎng)需求增加。Seita.6G058300和Seita.4G231500啟動(dòng)子中含有預(yù)測(cè)到的所有元件，這表明Seita.6G058300和Seita.4G231500在響應(yīng)環(huán)境信號(hào)發(fā)面有著重要的作用。與擬南芥類似，谷子NRT1基因的表達(dá)具有組織特異性，表明NRT1基因家族在谷子不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期以及不同組織和器官中各司其職，共同促進(jìn)植物對(duì)氮素的吸收利用。Seita.1G210500和Seita.5G424900在谷子所有組織中都表達(dá)，這兩個(gè)基因可能在谷子的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。

表3 谷子NRT1家族啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)Table 3 Predicted cis-acting elements of NRT1 family in Setaria italic

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